宏基因组学揭示水生真菌多样性评估受限于当前数据库的瓶颈

本文通过分析26个北方和亚北极湖泊及一个热带水库的宏基因组数据，系统评估了水生真菌和卵菌（Oomycota）的群落结构及其环境驱动因子。研究发现湖泊身份、深度分层和季节变化是解释真菌组成变异的主要因素，总有机碳（TOC）是显著的解释变量。尽管存在地理和时间差异，优势真菌门、目和属在所有湖泊中高度一致。研究特别以卵菌属疫霉（Phytophthora）为例，揭示了当前参考数据库在物种水平分类解析度上的局限性，凸显了公共数据库中水生真核生物基因组代表性不足这一持续存在的瓶颈问题。

　　

Abstract

真菌在生态系统中扮演着关键角色，但其在水生环境中的多样性研究远不如陆地系统深入。为填补这一空白，本研究分析了来自北方和亚北极地区26个湖泊以及一个热带水库的宏基因组数据，以表征真菌和类真菌卵菌（Oomycota）的群落结构，并探究了塑造这些群落的环境因素。真菌组成的大部分变异可由湖泊身份、深度分层和季节解释，其中总有机碳（TOC）是一个显著的解释变量。尽管存在地理和时间差异，所有湖泊中的优势真菌门、目和属高度一致。然而，属水平的变化表明，碳底物可用性的差异可能影响了明显的群落组成差异。试图将宏基因组读段分类至物种水平的努力——以充分表征的卵菌属疫霉（Phytophthora）为例——受到当前参考数据库有限分类解析度的制约。虽然宏基因组学为研究整个微生物群落提供了强大手段，但我们的结果强调了一个持续存在的瓶颈：公共数据库中对水生真核生物基因组的代表性不足。

Introduction

真菌几乎存在于地球所有生境中，从人体到南极沉积物，估计贡献了全球生物量的约2%。在陆地环境中，真菌作为分解者、腐生菌、寄生虫、共生体和坏死营养菌，在养分循环中发挥关键作用。然而，对于水生生态系统，真菌的多样性及其功能角色了解甚少。历史上，由于参考数据库中的代表性不足，真菌在水生环境中的表观丰度较低，尽管真菌可占水生微型真核生物的33%。最近的高通量测序工作揭示，水生系统中的真菌多样性被严重低估，真菌在海洋和淡水系统的真核读段中占相当大比例。这些发现暗示真菌在这些生境中也扮演关键的生态和生物地球化学角色。

水生真菌广义上指依赖水生栖息地完成全部或部分生命周期的真菌。根据对水生栖息地的依赖程度、适应水平和活动水平，这些系统中的真菌可大致分为从最适应到最不适应的居民、周期性移民和多功能移民。分类也基于功能性状进行，这可能比系统发育更适用于理解真菌在水生系统中的生态和生物地球化学作用。关键的水生真菌类群包括通常与溪流中落叶相关的水生丝孢菌、在静水贫营养区寄生或腐生的壶菌（Chytridiomycota），以及广泛存在于淡水贫营养区的酵母。卵菌虽非真真菌，但常被归类为类真菌生物，通常腐生，但也包括动物和植物的主要寄生虫和病原体。

虽然大多数关于水生真菌群落生态和多样性的研究基于高通量测序扩增的18S核糖体RNA基因或核糖体RNA基因间隔区（内部转录间隔区；ITS），但由于引物偏倚，许多未知真菌可能未被检测到。为克服这一限制，我们探索了使用鸟枪法宏基因组测序来表征真菌和卵菌群落组成，并识别其可能的环境驱动因素。我们分析了来自瑞典和芬兰北方和北极地区26个湖泊的样本，并包括一个热带水库作为外群，以更好地背景化北方和亚北极湖泊中观察到的真菌群落。虽然我们的主要目标是评估宏基因组学在捕捉水生真菌多样性方面的表现，但作为一个补充案例研究，我们聚焦于卵菌属疫霉（Phytophthora），以评估宏基因组数据集中的物种水平分类。疫霉是一个充分表征的卵菌属，具有生态和经济重要性，包含几种影响作物和森林树木的著名植物病原体。最近的调查已开始绘制其在北部水体中的分布，强调了将该类群纳入我们分析的价值。通过这一方法，我们旨在评估宏基因组学不仅在捕捉真菌生物多样性方面的潜力，而且为未来水生系统病原体监测工作做出贡献。

Materials and methods

Sample and data processing and chemical analyses

本研究中使用的湖泊样本及其宏基因组是多次采样活动的结果。简言之，从26个淡水湖泊（表1）收集了贫营养样本，以下简称“湖泊数据集”。微生物细胞通过过滤到0.2μm滤膜上收集，对于16个湖泊，即包括来自多个深度的130个样本，代表从表层到底部氧气减少和营养浓度增加的梯度。测量了不同采样活动的不同水化学变量，包括：溶解氧（DO）、总氮（TN）和总有机碳（TOC）。这些分析在Buck等人中有详细描述。

对于一个湖泊（Mekkoj?rvi），包括了2011-2013年无冰季节的多年时间序列数据以评估真菌群落的稳定性（以下简称“时间序列数据”），对于另外两个湖泊（Alinen Mustaj?rvi和Lomtj?rnan），包括了多年和多深度的样本以估计不同真菌类群垂直分布的稳定性（以下简称“垂直稳定性数据”）。对于所有样本，我们收集了最多1升水或直到滤膜堵塞的细胞。滤膜随后在处理前存储在-80°C，所有样本的总DNA使用PowerSoil DNA提取试剂盒按照制造商说明提取。测序文库使用ThruPLEX DNA-seq Prep Kit从10或20ng DNA制备，遵循制造商制备协议。质量控制和文库制备后，样本在乌普萨拉大学瑞典国家基因组基础设施SciLifeLab操作的Illumina NovaSeq 6000仪器上测序。

Analysis of fungal reads

我们的宏基因组数据集总共包括1.28 TB数据（5,391,550,241读段）。原始数据首先使用Trimmomatic修剪，之后所有读段使用Kaiju进行物种分类。我们使用了修改版的kaiju_nr_euk数据库，其中包括国家生物技术信息中心（NCBI）nr数据库，并添加了来自联合基因组研究所MycoCosm数据库1000真菌项目的真菌基因组集合。我们以贪婪模式运行Kaiju，其中最小匹配分数阈值设置为75，允许五个错配。Kaiju输出中大部分读段（31.1%至76.7%）保持未分类，这些被排除在进一步分析之外（表1）。为了分析湖泊中真菌和卵菌群落的组成，我们包括了所有被分类为真菌或卵菌的读段。对于这些，我们估计了真菌和卵菌读段相对于所有分类读段的比例。随后，我们编制了所有被分类为真菌和卵菌目和属的读段计数。在进一步分析之前，表格归一化至最少代表样本中的读段数（162,786读段）以解释样本间可变测序努力。对于涉及alpha多样性的统计检验，在组合归一化湖泊数据集140个样本中读段数少于1000的类群被丢弃。对于beta多样性和置换多元方差分析（PERMANOVA）分析，数据进行了Hellinger转换。

通过检索所有分配给该属的读段并使用Kaiju和内部数据库在物种水平对其进行分类，评估了不同疫霉（Phytophthora）物种的丰度。这些计数通过计算每个物种在每个样本中占总分类读段的比例进行归一化。

Statistical analysis

使用六个与多样性相关的不同指数从归一化表格计算真菌和卵菌群落的alpha多样性指数：Shannon和逆Simpson指数（丰富度和均匀度）；观察到的类群数、Chao1和基于丰度的覆盖估计器（丰富度）；以及Pielou's（均匀度）。使用Kruskal-Wallis检验评估湖泊间多样性差异，并对具有显著差异的指数应用Dunn's事后检验（使用Bonferroni方法进行多重检验校正）。使用非度量多维标度（NMDS）可视化湖泊间群落组成的变异性。对于每个深度分层，使用多元离散度的置换分析（PERMDISP（betadisper）函数）评估beta多样性，以检查每个样本与组质心的偏差。使用vegan包中的permutest函数验证组间差异。使用vegan包中的adonis函数进行PERMANOVA分析，以确定湖泊、深度分层和季节是否显著影响群落组成，并使用pairwise adonis函数检查组间差异。我们选择了对大多数样本测量的环境变量， resulting in a subset of 52 samples for which TOC, TN, and O₂ were available. 对于该子集，应用PERMANOVA（边际效应）和Mantel检验分析总群落组成与这些核心环境因素之间的关系。使用Spearman等级相关检验所有样本可用的氧气浓度与真菌丰度之间的相关性。

Results

Fungal and oomycete diversity and environmental correlates in the lake dataset

总湖泊数据集产生总共5,391,550,241读段，其中2,494,460,807可被分类（46.3%），其中1.1-1.3%在不同分类等级上被Kaiju注释为真菌。对于卵菌，分类读段占总注释读段的0.01%至0.4%（表1）。正如预期，分类等级越高，可注释读段的比例越高。然而，从真菌属获得的读段多于科，因为NCBI中有些属没有科分配（支持信息表S1）。

样本中真菌读段的比例范围从湖泊缺氧底层（hypolimnion；M=2.3%，SD=1.4）的1.1%到富氧表层（epilimnion；M=4.0%，SD=1.5）的11.4%。其中，被指定为源自卵菌的读段在所有湖泊的hypolimnion中≤0.2%，在epilimnion中≤0.4%（支持信息表S2）。尽管从湖面到底部真菌丰度似乎有下降趋势，但真菌或卵菌丰度与氧气浓度之间没有显著相关性。

跨不同湖泊和分层测试了alpha多样性指数，其中以下显著：Shannon（湖泊：χ²=55.1，p=0.001；分层：χ²=20，p=0.0000449），逆Simpson（湖泊：χ²=54.3，p=0.001389；分层：χ²=20.2，p=0.00004105）和Pielou's（湖泊：χ²=55.6，p=0.0009781；分层：χ²=19.5，p=0.00005745）。Bonferroni校正后，湖泊的事后检验不显著。事后检验显示，hypolimnion与其它分层在Shannon、逆Simpson和Pielou's上显著不同（p<0.05）（支持信息图S1）。

我们还调查了哪些环境因素（TOC、TN和O₂）最好地解释了湖泊数据集52样本子集中目水平的群落组成。在目水平，TOC（p=0.000999，F=5.01）和TN（p=0.0003996，F=3.92）分别解释了8%和6.3%的变异。在属水平，TOC（p=0.000999，F=5.8）和TN（p=0.001998，F=4.03）分别解释了9.5%和6.6%的变异。在目水平，O₂也显著（p=0.016983，F=2.65）并解释了4.3%的变异。在属水平，O₂也显著（p=0.02，F=2.3）并解释了3.7%的变异。随后的Mantel检验显示，只有TOC与群落组成显著相关（p=0.0003），在目水平解释了26%的变异。在属水平，TOC解释了23.7%的变异（p=0.0005）当仅考虑卵菌群落时，只有O₂与群落组成显著相关（p=0.024，F=4.18；R²=0.073）在目水平，但在属水平不显著。这些环境变量也使用vegan包中的envfit函数拟合到非度量多维标度图中（图2；支持信息图S2a,b）。

Community composition

在真菌门方面，所有湖泊中最丰富的门是子囊菌门（Ascomycota），在个体样本中贡献了高达68.5%的所有真菌读段（支持信息图S3；支持信息表S2；M=48.3%，SD=4.97）。其次是担子菌门（Basidiomycota）（高达44.97%，M=38%，SD=3.96）和壶菌门（Chytridiomycota），在个体样本中贡献少于10%（M=4.9%，SD=1.6），除了一个样本有16%的读段分配给该组。毛霉门（Mucoromycota）、虫霉门（Zoopagemycota）和芽枝霉门（Blastocladiomycota）在个体样本中分别贡献了高达9.4%、4.8%和1.14%的所有真菌读段。这些门在大多数湖泊中被发现，平均丰度分别为5.5%（SD=1.3）、2.6%（SD=0.7）和0.65%（SD=0.17）。有趣的是，热带水库（La Plata）具有与北方和亚北极湖泊相似的整体群落组成（图1,2；支持信息图S2a,b）。最后，卵菌贡献了高达0.37%的所有分类读段，所有样本中属于卵菌的读段平均比例为0.1%（SD=0.09）。

关于真菌目，45个真菌和两个卵菌目在组合湖泊宏基因组中由超过100,000读段代表（支持信息图S4）。当仅包括由至少1000读段代表的目时，个体湖泊中发现的目数范围从28到56，其中25个存在于所有湖泊中（支持信息表S3）。目水平的整体真菌和卵菌群落组成在湖泊间不同（支持信息图S4；PERMANOVA：p<0.001，F=2.9，R²=0.3），分层（p<0.001，F=14.4，R²=0.12）和季节（p<0.001，F=3.7，R²=0.05）。深度分层间的成对分析显示，hypolimnion群落与epilimnion和metalimnion显著不同（p<0.05）。总体而言，每个目在所有湖泊中具有非常相似的比例，只有微小偏差。最易变的目是酵母目（Saccharomycetales），它是跨湖泊第二丰富的目。最丰富的目是伞菌目（Agaricales），其次是酵母目、多孔菌目（Polyporales）、散囊菌目（Eurotiales）和肉座菌目（Hypocreales）（支持信息图S4；表S3）。还有16个其它目始终存在于所有湖泊中，丰度在1%到5%之间。此外，卵菌的四个目（霜霉目Peronosporales、腐霉目Saprogeniales、白锈菌目Albuginales和腐霉目Pythiales）始终存在于所有26个湖泊中。对于最丰富的属（那些在整个数据集中有超过100,000读段的），669个中的654个存在于所有样本中。

在属水平，整体真菌和卵菌群落组成在湖泊间不同（图1：PERMANOVA：p<0.001，F=3.26，R²=0.37），分层（p<0.001，F=9.8，R²=0.09）和季节（p<0.001，F=3.03，R²=0.04）。在整个宏基因组数据集中识别出20个优势属，读段数>100,000（表2）。分层之间，hypolimnion在指数Shannon、Pielou's和逆Simpson上呈现出较低的alpha多样性（支持信息图S1A）。群落组成（即beta多样性）在深度分层之间没有显著差异（无论在目或属水平），如离散度分析所示。

Phytophthora

在最丰富的属中，疫霉（Phytophthora）是唯一属于卵菌的（表2）。在物种水平，Kaiju识别的最丰富物种是 Phytophthora megakarya（M=11.4%，SD=4.6）、Phytophthora parasitica（M=9.4%，SD=5.0）、Phytophthora sojae（M=8.0%，SD=2.0）和 Phytophthora cactorum（M=7.1%，SD=4.2）。

Stability of the fungal communities over time and seasons (spring, summer and autumn)

来自三个湖泊的样本收集了多年，包括对Mekkoj?rvi湖hypolimnion的更密集采样（支持信息图S5，时间序列数据）和对Lomtj?rnan和Alinen Mustaj?rvi湖的重复采样（图3；垂直稳定性数据）。在所有有时间序列数据的湖泊中，最丰富的类群与完整湖泊数据集中的观察结果一致。Mekkoj?rvi湖hypolimnion中真菌的丰度较低但相当稳定，在三年期间，时间序列中真菌和卵菌读段占总分类读段的平均比例分别为0.9%（SD=0.1）和0.01%（SD=0.003）（支持信息图S5）。Mekkoj?rvi的广泛采样努力表明，通常真菌群落的组成相当稳定，相同的类群存在于不同季节。我们还在数据集中的所有湖泊中观察到相似的群落组成，真菌组成的主要变异是酵母目（属 Saccharomycodes）的比例。时间序列包括大多数时间点的重复样本，但在大多数情况下，酵母目丰度的增加仅在一个生物学重复中观察到，表明它们的分布是斑块状的，可能与颗粒相关。

在多年不同场合采样的Alinen Mustaj?rvi和Lomtj?rnan湖的群落组成，在酵母目丰度上具有相同的高变异，而其它目较不易变（图3）。然而，与年际变异相比，酵母目的相对丰度在深度剖面中相当一致（图3）。

Discussion

我们使用鸟枪法测序探索了斯堪的纳维亚淡水湖泊中的真菌和卵菌多样性，扩展了当前对未被充分研究的群落的知识。总体而言，我们的结果表明，真菌和卵菌通常构成北方湖泊微生物群落中相对较小但稳定的部分。真菌和卵菌对总微生物群落的贡献高达11.4%（相对丰度），与最近一项报告热喀斯特池塘中细菌、古菌和真核生物分布的研究一致。虽然不占主导地位，但它们的生态重要性不应被低估。真菌已被证明通过为微生物循环提供底物来支持陆源碳周转，并且最近对模型水生群落的研究揭示真菌是必需化合物如吡哆醇和硫胺素的唯一生产者，突出了它们作为对群落功能关键的“公共物品”提供者的角色。

湖泊身份、深度分层和季节对目和属水平的群落组成有显著影响。湖泊身份解释了大部分变异（高达30%），其次是深度分层（约10%）。确实，居住在hypolimnetic水域的群落与其它分层不同，尽管少数目在整个水柱中占主导地位。然而，氧气仍然不是群落组成的主要驱动因素，表明hypolimnion中的氧气耗尽可能不是随着深度增加群落组成变化的基础结构因素。季节效应仅限于5%的变异，这也在Mekkoj?rvi湖的时间序列中观察到，从三月到九月群落组成相当一致（支持信息表S2）。尽管跨站点、深度和季节观察到变异，但相同的真菌目和属倾向于在所有湖泊中占主导地位。虽然不完整的参考数据库可能有助于这种模式——可能夸大充分表征类群的相对丰度——但类似的海洋宏基因组研究，尽管面临可比较的数据库限制，通常揭示更大的空间变异。这表明观察到的均匀性也可能受到其它因素的影响，例如环境过滤。这里，生态上相似的斯堪的纳维亚湖泊可能扮演更强的角色， favoring a limited set of taxa adapted to local conditions. 有趣的是，研究中包括的一个热带外群湖也显示出相似的群落结构，尽管作为单个站点，很难评估这是否反映了真实的生态信号。这些发现强调需要包括更多样化地理区域——特别是热带和亚热带系统——的更广泛研究，以更好地理解真菌群落结构的全球驱动因素。

在我们分析中包括的所有水化学变量中，有机底物（以TOC为代表）是解释可变群落组成的最有影响力的因素。我们还强调，目和属水平的所有统计分析导致相似的结果。然而，不可否认，我们的环境变量集有限，可能还有比有机碳量更重要的因素，包括这些潜在底物的组成和质量。然而，与我们的发现一致，最近一项包括斯堪的纳维亚77个寡营养湖泊的研究也发现TOC与水生真菌群落组成之间的显著相关性，并且这种模式在最近一项关于热喀斯特池塘的研究中得到证实，揭示了碳质量和数量对真菌群落的显著影响。考虑到真菌通常被认为是各种碳化合物的高效降解者，有机底物可用性会影响真菌群落并不令人惊讶。

与之前的研究一致，子囊菌门是所有湖泊中的优势门，其次是担子菌门、壶菌门和毛霉门。然而，在一项针对斯堪的纳维亚寡营养湖泊的研究中，壶菌门被确定为最丰富的组，而子囊菌门和担子菌门代表了检测到物种的最大比例。壶菌门，连同隐菌门，也被发现在南极冰覆盖湖泊中主导真菌群落。在我们的研究中，这些居民在总真菌群落中的比例范围从3%到16.1%，并且只有一个壶菌，Cladochytrium，属于丰富属。与其代表真正的生物地理模式，这种不同的发现可能反映了当前数据库中对水生真菌的覆盖不足，使得很难（如果不是不可能）知道有多少真菌群落多样性被忽视，特别是在我们的案例中，没有使用基于扩增子的数据库，而是使用了一个域的全部基因池，其多样性未被完全覆盖。已知壶菌门和Rozellomycota的谱系在当前数据库中严重未被充分代表。真菌生物多样性中明显对比模式的另一种解释是跨研究使用不同引物。所有之前引用的研究都基于扩增子和不同的引物组，可能对或反对特定的真菌组有偏倚。

我们研究中许多优势子囊菌目（表S3）如酵母目、散囊菌目、肉座菌目和格孢腔菌目已知具有水生物种，可能代表活跃的居民。相反，丰富的担子菌目如伞菌目、多孔菌目、红菇目和牛肝菌目通常是陆生的，可能反映了群落中非活跃或短暂成员。虽然有一些真正的水生伞菌目，但该目的大多数物种已知是陆生的。红菇目和牛肝菌目的许多成员是菌根真菌，依赖植物宿主维持生长，而多孔菌目的大多数成员是木材分解者。当典型的土壤真菌在水生栖息地被检测到时，它们可能通过来自陆地周围径流进入水生系统。因此我们推测，在湖泊中发现的这些真菌部分可能代表了短暂类群，它们会随时间到达和下降，并且可能在水生系统中没有主要的生态或生物地球化学作用，除了作为营养补贴。这指出了我们方法的缺点；当调查基于从水中提取的DNA时，这部分材料的可变部分可能源自不再存活的生物。因此，需要实验或补充的宏转录组检测来确认我们研究中发现的哪些类群是活跃的。这些发现还表明，陆地周围可能强烈塑造水生真菌群落，和/或物种分配被以陆生物种为主的参考数据库扭曲。

有趣的是，酵母目和属 Saccharomycodes 的比例在湖泊间特别易变，并且是最丰富的属。这些是腐生子囊菌酵母，已知能够发酵糖，并且大多与葡萄酒行业有关，而对其在自然环境中的生态作用知之甚少。在时间序列数据集中，我们有来自同一时间点但来自湖中不同位置的重复样本，大多数具有增加酵母目丰度的时间点仅在两个重复样本之一中该类群比例较高。这表明该类群相对丰度的变化可能非常局部或斑块状，并且可能，例如， due to particles carrying a large number of spores or organic particles that undergo active fungal degradation rather than a systematic increase in the relative abundance across the entire water mass. 然而，我们的数据不允许我们解析酵母目相对丰度变异背后的因素，以及该类群是否对总湖泊代谢重要应进一步审查。

卵菌的疫霉属（Phytophthora）是我们数据集中最丰富的属之一。该属包含几种侵略性植物病原体，已知通过水道传播， thereby threatening the surrounding forest ecosystems. 重要的是，疫霉物种已知栖息于陆生和水生环境，使它们特别适用于陆水生态系统界面研究。它们在土壤和淡水系统之间移动的能力突出了它们作为监测生态系统连通性和干扰的哨兵生物的潜力。在本研究中，我们将该属分类到物种水平，以查看分类是否对应于预期的疫霉群落组成。我们发现12个识别物种中的9个是作物病原体，尽管湖泊不在作物田直接附近。出乎意料的是，没有一个识别物种属于枝6或9，它们在全世界水体中主要具有腐生生活方式，并且始终在瑞典溪流中发现。在我们的研究中，最丰富的识别疫霉物种属于陆生枝：作物病原体 Phytophthora megakarya（枝4）和 Phytophthora sojae（枝7b）；以及森林病原体 Phytophthora cactorum（枝1b）和 Phytophthora kernoviae（枝10）。Phytophthora cactorum自1961年和1991年以来分别在瑞典和芬兰森林苗圃中频繁报道。这些陆生枝可能通过连接的溪流网络或通过空气传播到达湖泊。然而，物种分类应谨慎解释，特别是考虑到缺乏水生代表。对基因组数据库的仔细审查显示，水生疫霉物种实际上缺失，因此可能被分类为其它疫霉物种。这突出了当前数据库关于真菌/卵菌生物的不良状态，并强调虽然鸟枪法测序基本上无偏倚，但我们仍然无法精确识别许多群落成员。

Conclusions

我们对淡水真菌和卵菌群落的探索性研究表明，鸟枪法测序是研究真菌群落的有前途工具。然而，我们试图将病原疫霉分类到物种水平清楚地说明了当前数据库中对水生枝物种代表性不足所施加的限制，并强调了增加微生物真核生物参考基因组测序工作的必要性。跨湖泊数据集的真菌群落分析表明，虽然群落组成在湖泊间变化，但它们与土壤群落不同，并且可能较少受到输入真菌的影响，因为我们在湖泊间没有看到多样性差异。我们的调查进一步表明，有机底物可用性可能是塑造真菌群落的一个有影响力因素。由于有机碳底物的可用性与周围流域的特征紧密相连，可以假设湖泊周围区域的变化，如皆伐或由于气候变化增加地表径流，可能对湖泊真菌群落产生 drastic impact. 我们得出结论，湖泊中的真菌群落对湖泊微生物多样性有显著贡献，并呼吁更多努力增加数据库中真菌基因组多样性的覆盖。