重构dsz途径强化恶臭假单胞菌对二苯并噻吩的生物脱硫能力

本研究报告通过理性设计恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）菌株，实现了对原油中典型杂环硫化物二苯并噻吩（DBT）的特异性脱硫。研究重点针对天然红球菌（Rhodococcus qingshengii）IGTS8的dsz操纵子进行重构优化，包括基因重排（dszBCA顺序）、核糖体结合位点（RBS）优化、异源启动子驱动组成型表达，并整合至基因组编辑菌株P. putida EM384的Tn7位点。最终获得的工程菌株P. putida DS006在模型双相生物脱硫系统中展现出卓越的DBT脱硫活性和稳定性，为替代高能耗加氢脱硫（HDS）技术提供了可持续解决方案。

　　

2-HBP耐受性评估与宿主选择

研究团队通过系统评估不同细菌宿主对生物脱硫关键代谢物2-羟基联苯（2-HBP）的耐受性，发现经过基因组精简的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）EM384在600-1100 μM 2-HBP浓度下均表现出最优生长性能。相较于大肠杆菌MG1655、假单胞菌S12/KT2440及其变异株EM42，EM384的耐受优势与其保留鞭毛结构密切相关，这为后续脱硫途径的植入提供了理想底盘。

dsz操纵子的理性重构与优化

从红球菌IGTS8中克隆的dszA、dszB、dszC基因通过SevaBrick组装系统被构建为8种不同排列组合（DS001-DS008）。研究显示，采用优化核糖体结合位点（BBa_B0034）并调整基因顺序为dszBCA的DS006构型，在质粒和基因组整合版本中均表现出最高催化效率（36 U/mg_DCW）和最低代谢负担。该构型有效解决了天然操纵子存在的翻译耦合问题，避免了中间产物DBTO₂的积累，实现了DBT到2-HBP的完全转化。

生物反应器性能验证

在7升生物反应器中，基因组整合DS006构型的工程菌虽在单位细胞脱硫活性（Units/mg_DCW）上略低于天然菌株IGTS8，但其最大比生长速率（μ_max=0.47 h^-1）达到红球菌的5.9倍，整体容积生产率提升超100%。更重要的是，DS006在指数生长期维持稳定的脱硫活性，而IGTS8则出现显著衰减，这表明重构操纵子能平衡Dsz酶系表达比例。

双相系统工业适用性评价

在正十二烷/水双相体系中，DS006在延迟期和稳定期均展现出持续脱硫能力。数学模型分析揭示其活性组分包含时间不依赖性部分（参数y₀），而IGTS8的活性完全随时间指数衰减。当综合考虑培养时间与脱硫时长时，DS006的总2-HBP生产率较天然菌株提高300%，证明其更适合实际石油脱硫场景。

技术突破与工业前景

该研究通过合成生物学手段实现了：① 宿主底盘的环境适应性改造；② dsz操纵子的基因顺序理性重排（dszBCA）；③ 翻译起始位点优化；④ 染色体稳定整合。所获工程菌P. putida DS006突破了天然菌株生长缓慢、活性不稳定的技术瓶颈，为开发低能耗、高特异性的化石燃料生物脱硫工艺提供了全新解决方案。