大肠杆菌IscR的[2Fe-2S]簇在响应氧化还原循环剂中的核心作用及其调控机制研究

本综述深入探讨了氧化还原循环剂（如PMS）通过直接氧化大肠杆菌IscR转录因子的[2Fe-2S]簇（从[2Fe-2S]1+到[2Fe-2S]2+状态）来调控其活性的分子机制。研究发现，这一氧化过程削弱了IscR与isc启动子中1型位点的结合能力，导致isc操纵子（编码ISC铁硫簇生物合成机制）的去抑制。在厌氧条件下，PMS处理主要影响isc的表达；而在有氧条件下，PMS还会通过产生超氧化物（superoxide）促进簇的降解，增加apo-IscR（无簇IscR）的积累，从而进一步激活suf操纵子（编码SUF替代性铁硫簇生物合成通路）的表达。这项工作揭示了IscR作为一种关键的氧化还原传感器，在细菌应对氧化应激和维持铁硫簇稳态中的核心作用，为理解细菌在自然环境（如多微生物群落）中适应氧化还原循环剂压力的机制提供了新的视角。

　　

摘要

细胞响应生长抑制性氧化还原循环剂的机制尚未被完全阐明。在大肠杆菌K12中，IscR调节子（包括ISC和SUF铁硫簇生物合成机制）在面对这些试剂时呈现差异表达。本研究报道了一种氧化还原循环剂——吩嗪硫酸甲酯（Phenazine methosulfate, PMS）如何通过其[2Fe-2S]簇辅因子来调控IscR的活性。

1 引言

IscR是一个全局性转录因子，通过调控两个主要的铁硫簇生物合成通路——ISC（Iron Sulfur Cluster）和SUF（Sulfur Utilization Factor）的表达，在大肠杆菌和其他细菌的细胞铁硫簇稳态维持中扮演着核心角色。在铁硫簇需求增加的情况下，IscR会从抑制isc操纵子转变为激活suf操纵子，从而导致两个通路的上调。虽然这种适应对于满足多种条件下细胞对铁硫辅因子的需求至关重要，但IscR协调此响应的精确分子机制仍不完全清楚。

生化与结构研究为理解IscR功能提供了一个机制框架。在厌氧条件下分离的野生型IscR形成二聚体，每个单体配位一个[2Fe-2S]簇。当结合此簇时，IscR会抑制isc操纵子（其编码IscR本身和ISC生物合成机制）的表达。相反，缺乏任何簇的apo-IscR（无论是由于配体突变还是化学螯合所致）在调控isc转录方面是无活性的。然而，这种apo形式对于激活编码替代性SUF铁硫生物合成通路的suf操纵子表达是具备功能的。IscR对apo形式或[2Fe-2S]形式的偏好是由启动子区域中存在的DNA结合基序类型决定的。isc启动子具有专门结合[2Fe-2S]-IscR的1型基序，而suf启动子则包含一个能结合[2Fe-2S]-IscR或apo-IscR的2型位点。值得注意的是，尽管能结合两种形式的IscR，但含有2型基序的启动子需要apo-IscR才能通过某种未知机制进行有效的转录调控。

在有氧条件下，isc和suf操纵子的表达均高于厌氧生长，这表明O₂的可利用性调控着IscR的活性。莫斯鲍尔（M?ssbauer）和电子顺磁共振（EPR）光谱分析表明，在缺乏O₂的情况下，无论是完整细胞还是分离后的蛋白质，IscR主要包含一个还原的[2Fe-2S]¹⁺簇。暴露于O₂后，该簇被氧化为[2Fe-2S]²⁺状态。然而，簇的氧化似乎并不影响[2Fe-2S]-IscR与iscR启动子的结合亲和力，O₂也不会导致簇的显著分解，这使得其调控机制不同于众所周知的铁硫簇O₂传感器FNR。因此，一个新的模型被提出，认为有氧条件下isc表达的增加是由于[2Fe-2S]-IscR合成减少，而非簇的氧化和降解。在铁硫簇需求增加的情况下（如好氧生活），IscR被假设为与其他客户蛋白竞争获取铁硫生物合成机制的效率降低。其结果，[2Fe-2S]-IscR水平的降低导致isc表达的部分去抑制，而产生的apo-IscR则激活suf表达，形成应对铁硫需求的协调响应。此外，[2Fe-2S]-IscR主要依赖ISC铁硫生物合成通路进行簇组装，这表明IscR簇占据状态与调控isc操纵子表达的负反馈回路之间存在直接联系。

IscR也被认为参与响应氧化还原循环剂而上调isc和suf操纵子。这些化合物可以被合成，但它们也由多种细菌、植物、真菌和古菌天然产生。吩嗪是氧化还原循环剂的一个著名例子，由不同的假单胞菌属和链霉菌属物种合成并分泌。大肠杆菌和其他肠杆菌不产生氧化还原循环剂，但在天然的多微生物环境中可能会经常接触到这些化合物。这些化合物有一个共同特点，即它们在生理条件下易于被还原和再氧化。这将电子重新导向新靶标，可能破坏正常的电子流，从而损害细胞过程。此外，氧化还原循环剂会提高细胞内超氧化物水平，这可能 destabilize 脱水酶中的铁硫簇，从而增加对铁硫生物合成的需求。转录组学研究显示，添加氧化还原循环剂百草枯（paraquat）会提高isc和suf操纵子的RNA水平，尽管最初并未鉴定出负责的转录因子。使用lacZ融合或测量isc或suf操纵子表达的其他实验表明，IscR是细胞对另一种氧化还原循环剂PMS响应所必需的。然而，目前尚不清楚这些试剂是间接起作用（通过增加铁硫需求）还是直接起作用（通过使[2Fe-2S]-IscR失活，其方式类似于氧化还原传感器SoxR的氧化修饰，或是通过超氧化物导致簇不稳定）。

2 结果

2.1 IscR在介导对氧化还原循环剂PMS的响应中起关键作用

先前的研究表明氧化还原循环剂诱导isc和suf操纵子的表达。为了表征IscR在体内此响应中的作用，我们使用转录报告基因（PiscR-lacZ，因为iscR是isc操纵子的第一个基因）并通过量化IscR、IscS和IscU蛋白水平评估了PMS对isc表达的影响。用递增浓度的PMS处理好氧生长的细胞1小时显示，12.5 μM PMS导致PiscR-lacZ的最大去抑制，使表达增加8倍。在缺乏IscR的菌株中未观察到PMS诱导，证实了其在此响应中的关键作用。经PMS处理的IscR⁺细胞中的去抑制水平大约是iscR缺失菌株中观察到量的一半，表明在这些条件下有一小部分IscR仍保持活性。定量Western blot分析显示，与未处理的对照相比，暴露于12.5 μM PMS的细胞中IscR水平增加了17倍，这与PiscR的去抑制一致。类似地，操纵子其他成员IscS和IscU的蛋白水平也随着12.5 μM PMS显著增加，进一步支持了isc操纵子表达的增强。

我们假设在这1小时期间，PMS减少了活性[2Fe-2S]-IscR的池，导致isc操纵子去抑制。IscR水平的相应增加（推测大部分是apo-IscR）使我们测试含有2型基序的、由apo-IscR激活的启动子的表达是否也增加。确实，在有氧条件下，添加PMS后sufA和ydiU启动子的表达均升高，并且这种表达增加依赖于IscR。对于PsufA，所检测的PsufA-lacZ报告基因缺乏OxyR结合位点，排除了OxyR是PMS诱导表达的原因。同样，Fur介导的去抑制也不是PsufA被PMS诱导的原因，因为一个缺乏完整Fur结合位点的PsufA-lacZ变体在PMS处理后显示出可比的表达增加，并且一个合成的Fur报告基因（PfepBsyn-lacZ）的Fur介导抑制不受PMS的显著影响。总的来说，这些发现表明氧化还原循环剂调节IscR活性。

为了确定IscR响应PMS的速度，我们进行了一个时间过程实验。用好氧生长的细胞处理12.5 μM PMS，并在1小时内的不同时间点测量PiscR-lacZ活性。PiscR表达在添加PMS后5至10分钟内就开始增加。鉴于PMS对IscR依赖性基因表达的这种快速效应，我们假设PMS或PMS在体内产生的超氧化物作用于预先存在的[2Fe-2S]-IscR池以降低其活性。

2.2 超氧化物而非PMS改变IscR的[2Fe-2S]簇稳定性

为了测试体内PMS依赖性的[2Fe-2S]-IscR活性降低是否可以用[2Fe-2S]簇的不稳定化来解释，我们通过测量593 nm处铁结合ferene的吸光度在体外测定了簇的丢失。用20 μM PMS处理厌氧分离的[2Fe-2S]¹⁺-IscR（5 μM）后，未观察到593 nm吸光度（A₅₉₃）的变化，表明铁硫簇完好无损。相反，在PMS之外再引入空气会导致593 nm吸光度增加，表明铁释放和簇不稳定化。我们推断这种不稳定化是由PMS与O₂反应产生的超氧化物引起的，因为当超氧化物清除剂超氧化物歧化酶（SOD）被添加到测定中时，铁释放被显著抑制，并且单独空气不会增加593 nm的吸光度。由于PMS需要电子来源才能在此反应中产生超氧化物，我们提出还原的[2Fe-2S]簇充当电子供体，尽管不能排除其他可能性。总之，这些发现表明超氧化物而非单独的PMS促进IscR的簇丢失。

为了提供超氧化物在簇降解中作用的额外证据，我们使用了成熟的超氧化物生成系统：空气、次黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶。当厌氧分离的[2Fe-2S]¹⁺-IscR暴露于超氧化物生成系统时，观察到A₅₉₃的时间依赖性增加，表明铁释放。最大铁释放（对应于近100%的簇铁）在30分钟内发生。铁释放依赖于超氧化物生成系统，因为单独空气不会导致A₅₉₃增加。还通过监测IscR的[2Fe-2S]簇的特征紫外-可见光谱变化来测定簇丢失。如先前的EPR和莫斯鲍尔研究所显示，将厌氧分离的[2Fe-2S]-IscR暴露于空气中约5分钟会导致簇从[2Fe-2S]¹⁺氧化为[2Fe-2S]²⁺。在更长时间内，氧化的[2Fe-2S]簇的420 nm吸光度仅显示轻微下降，表明空气中簇降解缓慢。相反，将[2Fe-2S]-IscR暴露于超氧化物生成系统会导致指示加速簇丢失的光谱变化，这与ferene测定中与铁释放相关的A₅₉₃相呼应。超氧化物导致的簇降解速率经计算为4.8 × 10⁵ M^?1 s^?1，比暴露于空气的IscR更快。添加SOD将速率减缓至与单独空气相当的水平，证实超氧化物特异性加速了簇降解。

由于在这些体外系统中也可能产生一些H₂O₂，我们检验了H₂O₂是否也能通过直接向好氧条件下的IscR添加H₂O₂而导致[2Fe-2S]-簇降解。我们发现H₂O₂降解簇的速度比超氧化物慢，用100 μM H₂O₂处理20分钟后仅约30%的簇丢失。添加H₂O₂清除剂过氧化氢酶（catalase）可保护簇免于降解。因此，这些体外数据表明，与空气相比，超氧化物以及在较小程度上H₂O₂促进簇降解。

2.3 PMS抑制[2Fe-2S]-IscR的DNA结合

由于我们的体外数据表明PMS在厌氧条件下不会导致IscR的[2Fe-2S]-簇降解，我们假设PMS在这些条件下不应影响其DNA结合活性。然而，出乎我们意料的是，厌氧条件下的电泳迁移率变动分析（EMSAs）显示，用PMS处理厌氧分离的[2Fe-2S]¹⁺-IscR会损害其与1型位点的结合，与未处理的对照相比。为了确定PMS是否特异性作用于[2Fe-2S]形式的IscR，我们在相同条件下使用缺乏任何簇的变体IscR(C92A)（其对于结合2型IscR结合基序有功能）进行了EMSA。我们发现与未处理的对照相比，PMS不影响IscR(C92A)的DNA结合活性，表明PMS不会非特异性地阻碍DNA结合。为了量化PMS对[2Fe-2S]-IscR DNA结合亲和力的影响，我们在厌氧条件下使用荧光各向异性测量了IscR与含有1型位点的荧光标记DNA的结合。添加PMS使厌氧分离的[2Fe-2S]¹⁺-IscR的表观DNA结合亲和力减弱了至少50倍（未处理和PMS处理的IscR的表观K_d分别为22 nM和>1000 nM）。由于ferene结果表明PMS并未引起簇降解，而是可能引起簇氧化，我们考虑了PMS可以将[2Fe-2S]¹⁺簇氧化为[2Fe-2S]²⁺状态从而导致IscR DNA结合受损的可能性。簇氧化对DNA结合的影响是出乎意料的，因为我们先前对空气氧化的IscR的研究表明，将[2Fe-2S]¹⁺-IscR氧化为[2Fe-2S]²⁺簇并未改变IscR DNA结合亲和力。为了理解这种可能的差异，我们测量了暴露于空气15分钟的IscR的DNA结合（这段时间足以将[2Fe-2S]¹⁺簇氧化为[2Fe-2S]²⁺簇），并在好氧条件下测定了DNA结合。我们发现与厌氧PMS处理的IscR类似的IscR DNA结合受损。然而，当空气氧化的蛋白质的DNA结合在我们之前的Coy室中在厌氧条件下测定时，结合亲和力（K_d = 26 nM）几乎恢复到未处理蛋白质的水平，这表明[2Fe-2S]²⁺-IscR的簇可能被自动还原为[2Fe-2S]¹⁺状态。总之，我们的发现强调了IscR簇氧化状态在体外条件下调控与1型位点DNA结合的重要性。

2.4 在厌氧生长条件下，[2Fe-2S]-IscR对O₂或PMS的响应相似

上述结果预测，向厌氧生长的细胞添加O₂或PMS应氧化IscR的[2Fe-2S]¹⁺簇，并导致受1型位点调控的iscR启动子去抑制。为了检验这一假设，我们进行了一个时间过程实验，并在向厌氧培养物添加12.5 μM PMS后测量了PiscR-lacZ活性。IscR对PMS响应迅速，因为PiscR-lacZ表达在添加PMS后5至10分钟内就增加，与好氧细胞暴露于PMS时的响应时间相似。这些数据表明，仅PMS就足以在体内氧化并灭活[2Fe-2S]¹⁺-IscR。类似地，将厌氧生长的细胞转换到好氧生长条件也在引入O₂后5至10分钟内导致PiscR转录增加，表明在细胞中，PMS或O₂对IscR [2Fe-2S]¹⁺簇的氧化以相似的高速率发生。

重要的是，在厌氧条件下PMS处理后约20分钟观察到isc表达的新稳态，表明重新建立了一小池[2Fe-2S]¹⁺-IscR，并且在厌氧细胞暴露于O₂后也是如此。然而，对于好氧生长条件下的PMS处理，isc表达在60分钟内尚未达到新的稳态，并且在60分钟时表达比厌氧处理细胞高6倍。

2.5 超氧化物的体内作用

由于已知PMS在好氧细胞中会升高超氧化物水平，我们考虑到在好氧生长条件下，氧化的[2Fe-2S]²⁺簇可能被超氧化物 destabilized，正如我们的体外数据所提示的，这有助于图2a中好氧条件和PMS的叠加效应，并减少[2Fe-2S]¹⁺-IscR的池。为了检验超氧化物水平本身是否对IscR活性有影响，我们检测了一个sodAsodB突变体（sodA25::Mu dPR13 ΔsodB），该突变体由于缺乏胞质超氧化物歧化酶SodA和SodB而具有升高的超氧化物水平。与野生型菌株在标准好氧生长下的表达相比，PiscR-lacZ表达在此突变体中增加了约3倍。在此sodAsodB突变体中，对于apo-IscR激活的PsufA-lacZ或其缺乏完整Fur结合位点的变体，也观察到类似的表达增加。总之，这些发现表明超氧化物对好氧条件下增加apo-IscR池做出了可测量的贡献。虽然超氧化物的效应可能是直接的（通过促进簇降解），但也可能是IscR与其他铁硫蛋白底物之间竞争铁硫簇组装机制（在超氧化物存在下可能加剧）也导致[2Fe-2S]¹⁺-IscR合成延迟、apo-IscR积累以及在好氧生长条件下用PMS处理时isc转录稳态的改变。

2.6 [2Fe-2S]²⁺-IscR还原系统的候选者

总的来说，我们的数据表明簇氧化状态在调控[2Fe-2S]-IscR活性中起着重要作用，这与已建立的[2Fe-2S]-SoxR调控机制相似。对于SoxR，已证明rsxABCDGE、rseC和apbE基因产物形成一个复合物，利用还原剂NAD(P)H还原氧化的[2Fe-2S]²⁺簇。为了探究该还原系统是否在还原IscR [2Fe-2S]²⁺簇中也起作用，我们在一个缺乏rsxC和rseC的菌株中测量了PiscR-lacZ表达。我们观察到与野生型相比，此突变体在厌氧和好氧条件下表达仅有轻微（2倍）增加，表明RsxC和RseC对IscR [2Fe-2S]簇还原没有显著贡献。此外，在缺乏fpr（编码一种黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白-NADP⁺还原酶）的突变体中，IscR活性未受影响。最后，尽管缺乏由iscRSUAhscBAfdx操纵子编码的铁氧还蛋白的突变体在厌氧和好氧条件下均表现出[2Fe-2S]¹⁺-IscR活性的显著缺陷，但很难区分这是由于IscR [2Fe-2S]簇还原缺陷还是一般的细胞铁硫簇生物发生紊乱。

2.7 簇氧化似乎主要影响IscR对1型基序的调控

我们的结果表明IscR [2Fe-2S]¹⁺簇的氧化灭活了IscR与其在PiscR内的1型位点的结合。我们接下来测试了氧化的簇形式（[2Fe-2S]²⁺-IscR）是否能够调控具有2型基序的启动子。通过比较[2Fe-2S]¹⁺-IscR、[2Fe-2S]²⁺-IscR和apo-IscR在厌氧条件下对2型启动子报告基因（IscR抑制的PhyaAsyn-lacZ和IscR激活的PsufA(Fur*)-lacZ）的转录调控活性，并与1型启动子PiscR-lacZ进行比较，解决了这个问题。由于IscR水平受负自身调控，构建了菌株，通过将iscR置于Ptac控制下并用160 μM IPTG诱导，在厌氧条件下产生等效的IscR水平。充分表征的无簇变体iscR(C92A)被用作apo-IscR的代理。

正如预期，当培养物含有IPTG（代表在此IPTG浓度下产生的[2Fe-2S]¹⁺-IscR池）时，PiscR-lacZ的表达在厌氧条件下受到最大抑制。相反，经PMS处理的细胞显示出PiscR-lacZ的中等抑制量（4倍），与未处理细胞中的完全抑制（32倍）和对照菌株中含有apo-IscR [iscR(C92A)]的无抑制相比，表明存在PMS依赖性的部分向氧化的[2Fe-2S]²⁺-IscR池的转移。正如预期，2型调控的启动子PhyaA和PsufA显示出对apo-IscR的强烈偏好，以增强其抑制和激活 respectively，与WT IscR相比。此外，通过PMS添加将[2Fe-2S]¹⁺-IscR池转移到氧化状态并未改变2型启动子PhyaA和PsufA的表达，这与1型启动子不同。因此，这些数据表明[2Fe-2S]¹⁺簇氧化为[2Fe-2S]²⁺状态主要影响IscR对具有1型基序的启动子的调控。

2.8 IscR在减轻PMS引起的氧化应激中的作用

为了比较PMS介导的IscR调节子诱导对好氧生长的影响，比较了各种菌株背景在含有递增浓度PMS（2倍增量）的平板上的菌落形成单位。野生型亲本菌株在150 μM PMS下失去存活力，而缺乏IscR的菌株更敏感，在50 μM PMS下就失去存活力。先前的研究表明suf对PMS抗性有显著贡献，并且确实，我们观察到删除suf操纵子导致在25 μM PMS下存活力丧失。这提出了一个问题，即ΔiscR突变体的PMS敏感性是否是由于缺乏IscR对suf的激活。对IscR结合有缺陷的PsufA突变体的分析显示出与ΔiscR突变体类似的PMS敏感性，表明suf表达的减少是ΔiscR菌株PMS敏感性的一个主要贡献者。此外，这些发现表明IscR在减轻由PMS引起的氧化应激中起着重要作用。有趣的是，当平板在厌氧条件下培养时，ΔiscR和Δsuf突变体也表现出PMS敏感性，尽管PMS浓度比好氧条件下高2倍。这一观察暗示IscR和Suf对于抵抗PMS诱导的应激至关重要，即使在不存在超氧化物的条件下也是如此。

3 讨论

铁硫簇是促进生物界各种反应的关键蛋白质辅因子。虽然铁硫簇在厌氧条件下相对稳定，但某些簇类型在好氧生长条件下会被O₂、过氧化氢或超氧化物 destabilized，导致一些铁硫蛋白的 deficit。本研究调查了产生超氧化物的氧化还原循环剂PMS如何在好氧条件下导致isc和suf操纵子上调，从而增加铁硫簇生物合成机制的供应，以响应此类氧化应激条件来重建铁硫蛋白。我们发现PMS本身通过氧化其[2Fe-2S]¹⁺簇直接灭活铁硫簇生物合成的中心稳态调节器IscR。在好氧条件下，PMS引起的簇氧化触发一系列事件，导致SUF和ISC铁硫簇生物合成通路均上调。相反，在厌氧条件下，PMS对IscR的效应大多仅限于上调ISC铁硫生物合成通路。总之，这些发现揭示了IscR活性在体内是如何被调控的新见解及其在响应氧化还原循环剂时维持铁硫簇稳态的影响。

3.1 IscR的[2Fe-2S]¹⁺簇氧化导致与1型位点DNA结合丢失

我们的体外分析和厌氧生长测定表明，还原的[2Fe-2S]¹⁺-IscR最有效地结合isc启动子中的1型位点并抑制其转录。相反，将[2Fe-2S]¹⁺簇氧化为[2Fe-2S]²⁺簇——无论是通过O₂还是PMS——都足以在体外减弱与1型位点的DNA结合亲和力，并在体内解除对isc启动子的抑制。这一结果令人惊讶，因为先前的一项研究得出结论，O₂诱导的簇氧化并未改变DNA结合亲和力。然而，正如本文所示，预期簇在缺乏添加还原剂的厌氧条件下测定时会保持氧化状态显然是错误的。铁硫簇“自动还原”先前在少数蛋白质中有报道，但尚不十分清楚。尽管如此，[2Fe-2S]²⁺-IscR的DNA结合亲和力下降解释了isc启动子如何响应O₂或单独PMS而迅速去抑制，提高了isc操纵子的表达。

3.2 IscR的[2Fe-2S]¹⁺簇在响应氧化还原循环剂中起关键作用

发现IscR的[2Fe-2S]¹⁺簇可以被氧化还原循环剂直接氧化，这与氧化还原传感器SoxR的发现相似。氧化还原循环剂对二聚体SoxR的[2Fe-2S]¹⁺簇的氧化导致soxS的转录激活；SoxS进而诱导一个有助于防止氧化损伤的调节子的表达。氧化和还原的SoxR都结合一个与启动子元件重叠的DNA序列，但只有氧化的[2Fe-2S]²⁺ SoxR