视黄酸抑制改变斑马鱼肠道细胞组成：一个研究先天性巨结肠症的非遗传模型

本综述通过单细胞RNA测序技术，系统揭示了视黄酸（RA）信号通路在斑马鱼肠道发育中的核心调控作用。研究表明，RA抑制不仅导致肠神经系统（ENS）发育异常（表现为全结肠无神经节症），更显著改变了非神经元细胞群（包括上皮细胞、免疫细胞和细胞外基质细胞）的转录组特征。该工作首次在模式生物中建立了RA缺陷与先天性巨结肠症（HSCR）病理特征的直接关联，为理解环境因素（如维生素A缺乏）与遗传因素（如RET突变）在HSCR发病机制中的交互作用提供了全新视角。

　　

ABSTRACT

背景

视黄酸（RA）在肠神经系统（ENS）发育过程中起着关键作用，指导迷走神经嵴细胞在胃肠道中的迁移和分化。尽管RA对其他肠道细胞类型的影响已被认识，但其具体作用机制尚不明确。本研究利用斑马鱼模型探讨RA抑制对肠道组成的广泛影响，并评估其作为先天性巨结肠症（HSCR）研究模型的潜力。

方法

使用RA合成抑制剂二乙氨基苯甲醛（DEAB）处理斑马鱼幼虫，诱导出类似全结肠无神经节症的表型。通过单细胞RNA测序技术，比较DEAB处理组与野生型及^ret突变HSCR模型的肠道细胞组成差异。

结果

RA抑制不仅减少了ENS细胞数量，还引起了非神经元细胞群的显著变化。主要表现为上皮细胞增加、免疫细胞减少以及炎症通路抑制。此外，观察到肌成纤维细胞数量增加和成纤维细胞减少，提示可能存在纤维化现象。与^ret突变模型的比较分析显示，虽然两者对非神经元细胞都有深远影响，但大多数变化存在差异，突出了RA和Ret信号在肠道发育中的不同作用。

结论

这些发现强调了RA在维持肠道结构和免疫稳态中的关键作用，同时进一步支持了在HSCR研究中同时考虑神经元和非神经元细胞群的重要性。

Summary

• RA抑制诱导的转录变化提示神经元和非神经元细胞组成改变
• DEAB斑马鱼模型的转录变化与^ret突变模型不同
• 需要综合考虑神经元和非神经元肠道变化以更全面理解HSCR发病机制

1 Introduction

肠神经系统（ENS）是位于肌间和黏膜下神经丛的复杂神经元和胶质细胞网络，在调节胃肠道（GI）运动、分泌和血流中起关键作用。ENS主要来源于迷走神经嵴细胞（NCCs），这些细胞迁移进入并沿着肠道分布。这一复杂过程受到多种分子信号的影响，包括生长因子、转录因子和细胞外基质（ECM）成分，它们协调NCCs的分化、增殖和迁移以形成功能性ENS。

视黄酸（RA）作为维生素A的代谢产物，是该过程中的关键信号分子。RA通过两步酶促途径合成：首先，维生素A（全反式视黄醇）通过视黄醇结合蛋白4（RBP4）递送至靶细胞，并通过STRA6受体内化。细胞内，视黄醇通过视黄醇脱氢酶10（RDH10）氧化为全反式视黄醛，随后通过醛脱氢酶（ALDH1A1、ALDH1A2和ALDH1A3）转化为RA。RA作为转录调节因子，通过与核RA受体（RARs）和类视黄醇X受体（RXRs）结合发挥作用。这些受体形成异二聚体（RAR/RXR），结合特定的DNA序列称为视黄酸反应元件（RAREs），从而控制胚胎发育必需基因的表达。

由于RA影响众多发育过程，其细胞内水平必须精确控制，该分子的缺乏和过量都会导致严重畸形。在ENS发育背景下，RA信号对于肠NCCs存活、迁移和分化的协调调节不可或缺。Aldh1a2敲除小鼠模型显示由于迷走NCC迁移受损导致ENS形成完全失败，进一步证明了这一点。

先天性巨结肠症（HSCR）是一种严重的先天性畸形，特征为肠道远端ENS缺失。虽然HSCR主要是遗传性的，其中Rearranged during transfection（^RET）基因突变是最常见原因，但超过半数病例缺乏可识别的遗传解释。有趣的是，非神经元和环境因素在HSCR发病机制中日益受到认可。例如，由间充质细胞表达并对刺激肠NCC活性至关重要的胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和内皮素3（EDN3）通常与HSCR相关。维生素A也被认为是该疾病的重要风险因素，证实了充足RA水平对正常ENS发育的重要性。然而，其对更广泛肠道组成的具体贡献仍 largely unexplored。

斑马鱼为研究ENS发育提供了若干优势，包括外部发育、光学透明度、快速器官发生和与人类的遗传保守性。到受精后5天（dpf），斑马鱼表现出具有 established enteric innervation 的功能性GI道。它们的ENS完全来源于沿肠道头尾迁移的迷走NCCs，类似于哺乳动物早期ENS形成。尽管存在解剖简化（如缺乏隐窝和黏膜下层），斑马鱼肠道表达关键神经递质（如血清素、一氧化氮和血管活性肠肽），并表现出与哺乳动物相当的基因表达和功能特征。

为探索RA缺乏如何在细胞水平影响肠道发育，我们对用DEAB处理的斑马鱼幼虫肠道进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。该化合物通过药理学抑制RA合成，已被证明会导致结肠无神经节症，密切模拟HSCR。本研究选择关注全结肠无神经节症表型，因为它代表了该疾病最严重的形式，从而为研究ENS发育缺陷的基本机制提供了清晰一致的起点。通过scRNA-seq，我们能够表征ENS和非神经元细胞群的变化。此外，我们评估了RA介导的效应是否导致与遗传性HSCR模型^ret突变斑马鱼相似的改变。这种整合分析能够更深入理解环境（RA相关）和遗传（^RET相关）扰动的独特和重叠后果，为RA对肠道发育的作用以及HSCR发病机制带来更好理解。

2 Materials and Methods

2.1 Animal Husbandry

Tg(^phox2bb:GFP)斑马鱼TL背景在标准实验室条件下维持，温度28.5°C，光暗周期14小时/10小时。通过自然产卵收集胚胎，并根据既定方案分期。所有实验程序均经伊拉斯姆斯MC鹿特丹动物实验委员会批准，并遵循实验室动物护理和使用伦理指南。

2.2 DEAB Treatment

Tg(^phox2bb:GFP)斑马鱼胚胎从24.5 hpf到5 dpf用20μM DEAB处理。DEAB溶解于10% DMSO并加入鱼水中。在5 dpf，使用Leica M165荧光解剖显微镜检查斑马鱼，筛选具有全结肠无神经节症表型的个体。仅用10% DMSO处理的胚胎作为对照。未观察到DMSO效应。

2.3 Imaging

5 dpf Tg(^phox2bb:GFP)幼虫用DMSO或DEAB处理后，使用Leica M165荧光解剖显微镜和Leica LASX软件成像。幼虫在溶解于HEPES缓冲E3培养基的0.016% MS-222中麻醉，并置于涂有1.5%-2%琼脂糖的培养皿上侧位定位，以实现肠神经元的最佳可视化。

2.4 Isolation of Zebrafish Intestines

在5 dpf，使用甲磺酸三卡因（MS-222）安乐死斑马鱼幼虫，并在立体显微镜下仔细解剖肠道，立即置于冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）中并在冰上保存直至进一步处理。

2.5 Pre-Processing of Zebrafish Cell Suspension for scRNA Sequencing

解剖的肠道通过酶消化解离成单细胞悬液，通过35μm细胞筛网过滤到FACS管中，4°C下700g离心5分钟。去除上清液，细胞沉淀重悬于含10% FCS的PBS中。加入DAPI（1:1000）标记死细胞。使用FACSAria III将活的单细胞分选到含有5% FCS的PBS的Eppendorf管中。使用血细胞计数器计数细胞数，并用台盼蓝评估活力。

2.6 Library Preparation for Single Cell RNA Sequencing (scRNA-Seq)

使用Chromium Single Cell 3′ Library & Gel Bead Kit v3制备单细胞RNA测序文库。单细胞与带条形码的微珠在液滴中封装，使用Chromium Controller进行逆转录后，cDNA扩增，构建文库，并在Illumina NovaSeq 6000平台上测序以生成高通量单细胞转录组数据。测序深度为：DEAB处理组每细胞21,665 reads；野生型每细胞21,106 reads。测序读长为90碱基单端读长。

2.7 Single Cell RNA Sequencing Data Processing

原始测序数据使用Cell Ranger pipeline处理，进行解复用、比对到斑马鱼基因组（GRCz11）和基因表达量化。表达矩阵使用R包Seurat（版本5.1.0）处理。在进行全面数据分析工作流程之前，过滤掉低质量细胞（基因数>100且<4500，线粒体基因百分比<5%），以获得高置信度单细胞数据。使用标准Seurat v3整合工作流程进行样本间数据整合，并采用Harmony最小化批次效应，实现稳健的跨样本比较。随后，使用主成分分析（PCA）对整合数据集进行降维（前20个成分），接着使用均匀流形近似和投影（UMAP）进行可视化。应用SCTransform标准化调整测序深度和技术变异性，促进可靠的下游分析。使用默认Seurat聚类算法Louvain进行细胞聚类。基于已知标记基因表达和每个相关簇的基因本体生物通路（GP:BP）富集进行细胞类型鉴定。通过整合R包ClusterGVis进行标记基因基于GO:BP富集和结果可视化。使用Wilcoxon秩和检验与错误发现率（FDR）校正进行条件间差异表达分析，以识别显著差异表达基因。应用FDR<0.05、调整后p值<0.05和绝对Log2倍数变化>0.58作为差异表达基因阈值。基于Hallmark基因集使用R包fgsea（版本1.30.0）进行基因集富集分析（GSEA）。

3 Results

3.1 Impact of RA Inhibition on ENS Development and Intestinal Composition

先前研究中，从28到36 hpf用10μM DEAB处理导致76%斑马鱼显示全结肠无神经节症表型。而36 hpf后开始处理效果较轻，到48 hpf时肠道 colonization 基本正常，突出了RA抑制的时间敏感性。为优化该方法，我们测试了不同DEAB浓度（10、20、25和30μM）并将处理窗口从24.5 hpf延长到5 dpf。结果显示，从24.5 hpf用20μM浓度处理最有效，近90%斑马鱼呈现全结肠无神经节症且无可见畸形。相比之下，10μM DEAB仅导致30%斑马鱼出现全结肠表型，而更高浓度导致显著畸形，突出了该模型中精确剂量和时间的重要性。

为评估RA抑制对肠道细胞组成的影响，我们对5 dpf全结肠无神经节症DEAB处理幼虫肠道进行了scRNA-seq（n=277）。获得的数据与我们先前发表的野生型斑马鱼数据集（n=266）整合。过滤掉死细胞和双联体后，确定了19,121个单个细胞的基因表达谱（9010野生型；10,111 DEAB处理）。通过基于图的聚类，在整合数据中识别出9个 distinct clusters。这些包括表达ECM蛋白（^col1a1a、^col1a1b、^col6a1和^col6a2）、上皮细胞（^epcam和^krt92）和免疫细胞（^lcp1和^mpeg1.1）的细胞。此外，还识别出内皮细胞（^pecam1和^cdh5）、肌肉细胞（^acta2、^slc16a3和^inhbaa）、红细胞（^hbbe1.1、^hbbe1.3、^hbae3）和血小板（^itga2b、^gp1bb和^mpl）。尽管存在全结肠无神经节症，在DEAB处理斑马鱼中仍检测到少量ENS细胞（^phox2bb、^ret和^nos1）。

DEAB处理斑马鱼与野生型scRNA-seq数据比较显示细胞组成存在显著差异。DEAB处理导致红细胞、ENS细胞、血小板和免疫细胞减少，而上皮细胞、肌肉细胞和内皮细胞比例增加。这些细胞组成变化伴随着RA调节基因表达的变化，为理解潜在 disruption 提供了进一步 insight。具体而言，在ECM产生和肌肉细胞中，^aldh1a2和^rdh10a（编码RA生物合成关键酶的基因）表达增加，表明存在补偿机制以 counter 减少的RA合成。在ECM产生细胞中，还注意到参与RA降解的^cyb26b1表达减少，表明RA水平 disruption。相反，内皮细胞中^cyb26b1表达增加可能表明努力调节RA降解，可能以维持平衡的RA信号。此外，ECM产生细胞中RA受体^rarga表达减少表明RA信号活性受损。还观察到关键RA反应发育基因（如^hoxb1b和^hoxa5a）表达减少，强调了受损RA信号对组织规范和细胞命运决定的广泛影响。有趣的是，尽管先前研究显示细胞自主RAR信号对小鼠发育早期^Ret表达至关重要，但在5 dpf DEAB处理斑马鱼中仍观察到该基因表达。

由于红细胞、血小板、内皮和肌肉细胞数量相对较少，未对这些细胞类型进行进一步分析。

3.2 RA Inhibition Leads to Substantial Alterations in ENS Development

为进一步研究RA抑制对ENS的影响，我们进行了详细子分析，选择所有ENS簇。这种方法导致识别出12个ENS特定簇。这些簇包括Schwann细胞前体（SCPs）（^mmp17b、^clic6、^sox10）、抑制性运动神经元（^vipb、^nos1）、notch反应状态细胞（^her4.2.1、^her4.2）、分化中神经元（^phox2bb、^phox2a、^myt1b）、感觉内在初级传入神经元（IPANs）（^nmu、^tac3a）、^phox2bb阴性神经元（^elavl3、^sv2a、^sncb）、增殖细胞（^cdk1）、肠胶质细胞（^cx43、^sox2）、神经嵴祖细胞（^ncam1b、^hoxb5b）、早期发育细胞（^wnt11r、^cxcl12a）和迁移神经嵴细胞（^dkk1b、^emp3b）。

比较DEAB处理斑马鱼与野生型，观察到所有识别ENS簇细胞数量总体减少，除SCPs增加外。^Phox2bb阴性神经元减少最显著，在DEAB处理斑马鱼中几乎完全丢失。这些细胞似乎是GABA能肠神经元，因此可能参与GI运动和分泌所需的抑制功能。有趣的是，GSEA显示在DEAB处理斑马鱼中，神经嵴祖细胞、早期发育细胞和SCPs中细胞周期通路显著上调，表明这些群体中增强的增殖活性。

3.3 Transcriptional Changes in Epithelial Cell Populations in Response to RA Inhibition

为理解RA抑制对上皮细胞的影响，我们对上皮簇进行了子分析，识别出九个 distinct subclusters。这些 subclusters 包括不同细胞类型，如分化中上皮细胞（^epcam、^cldnb、^cotl1）、分化中肠细胞（^krt4、^krt8、^pdx1）、肠嗜铬细胞（^tph1a、^tph1b）和小簇杯状细胞（^agr2、^sstr5）。此外，识别出两个肠内分泌细胞亚簇：肠内分泌1（^neurod1、^ccka）和肠内分泌2（^neurod1、^pcsk2），以及三个 distinct 肠细胞簇：^best4/otop2肠细胞（^best4、^otop2）、前肠细胞（^ada、^acsl5、^apoc2）和中肠细胞（^fabp6、^slc10a2）。

比较DEAB处理斑马鱼与野生型，DEAB处理组中所有上皮亚型总体增加，除肠内分泌1外。值得注意的是，肠内分泌2和肠嗜铬细胞显示细胞数量最显著增加，表明谱系承诺向分泌细胞类型存在潜在 bias。GSEA揭示DEAB处理与野生型斑马鱼之间 hallmark 通路活性存在显著变化。肠嗜铬细胞显示糖酵解、氧化磷酸化和蛋白质分泌通路上调，表明代谢和分泌活性增强。在肠内分泌簇中，p53和TNFα via NFkβ信号通路均显著下调，表明这些细胞中应激反应和炎症信号可能减少。最显著变化出现在分化中肠细胞中。这些细胞显示增殖和细胞生长通路显著上调，包括MYC靶标激活和E2F靶标，表明细胞增殖增强。相反，炎症通路（如IL6-JAK–STAT3、KRAS和TNFα via NFkβ信号）显著下调。在前肠细胞中，检测到上皮-间质转化和肌生成通路显著上调，可能表明纤维化开始。

3.4 RA Inhibition Transforms the Immune Cell Diversity and Function

免疫细胞簇子分析揭示六个 distinct subclusters。识别出祖细胞（^coro1a、^ccr9a）、增殖免疫细胞（^csf1rb）、T/NK细胞（^mef2b、^sash1b、^runx3）、2型先天淋巴样细胞（^il4、^gata2a）和巨噬细胞（^c1qb、^mfap4）。值得注意的是，识别出由增殖性干细胞/祖细胞组成的额外簇，以^cdk1和^mki67表达为特征。

比较DEAB处理斑马鱼与野生型，观察到几乎所有免疫细胞群体轻微总体减少，除分裂免疫细胞和2型先天淋巴样细胞外。GSEA显示在DEAB处理斑马鱼中，免疫细胞 exhibited 关键炎症和应激反应通路显著下调，包括p53通路、干扰素γ（IFN-γ）反应、TNFα通过NFκβ信号和跨T/NK细胞、免疫祖细胞、分裂免疫细胞和巨噬细胞的一般炎症反应。这些发现表明缺乏RA时免疫激活和应激反应抑制。相反，细胞周期相关通路（如E2F靶标和G2/M检查点）在免疫祖细胞、分裂免疫细胞和巨噬细胞中显著上调，表明DEAB处理下免疫细胞增殖增强。

3.5 Altered ECM Regulation in DEAB-Treated Zebrafish

ECM簇子分析识别出总共11个 distinct subclusters。这些包括未成熟ECM产生细胞（^vim、^igfbp5b）、增殖细胞（^pcna、^hmga1a）和两个分化中间充质细胞簇（^hoxd12a、^spon2a）。还识别出三个成纤维细胞簇：成纤维细胞1（^foxf2a、^col6a4a）、成纤维细胞2（^podxl、^jam2b）和成纤维细胞3（^col2a1a、^cav2、^mmp2）。此外，观察到四个 distinct 肌成纤维细胞簇存在：肌成纤维细胞1（^desmb、^myh11a）、肌成纤维细胞2（^fn1b、^myl6）、肌成纤维细胞3（^acta2、^mylkb、^hhip）和肌成纤维细胞4（^tagln、^acta2）。

在DEAB处理斑马鱼中，与野生型相比观察到ECM细胞组成显著变化。具体而言，肌成纤维细胞数量增加，而成纤维细胞数量减少。成纤维细胞3在DEAB处理斑马鱼中显著缺失，表明RA抑制后成纤维细胞和肌成纤维细胞之间平衡发生显著改变。GSEA揭示成纤维细胞2和肌成纤维细胞1中通路显著调节，两个簇均显示由于细胞周期通路上调（包括E2F靶标和G2M检查点）导致增殖活性增强。在肌成纤维细胞2中，还观察到p53通路下调，这可能反映向增加存活、增殖和激活的转变。有趣的是，成纤维细胞2显示肌生成上调和TNFα通过NFkβ信号和KRAS信号下调。此外，通过评估数据集中识别胶原基因的胶原模块评分，在DEAB处理斑马鱼中与野生型相比，观察到成纤维细胞1和肌成纤维细胞1中胶原活性增加，表明DEAB处理斑马鱼中可能存在肠道纤维化增加。

3.6 Comparative Intestinal Composition in DEAB-Treated and ^ret Mutant Zebrafish

为确定RA抑制是否重现遗传性HSCR模型中观察到的细胞变化，我们将DEAB处理斑马鱼获得的scRNA-seq数据与先前描述的野生型和^ret突变（^rethu2846）斑马鱼数据集进行比较。两种HSCR模型均呈现全结肠无神经节症，显示ENS显著丢失，突出了这些通路对ENS发育的重要性。然而，虽然在^ret突变体中ENS几乎完全缺失，但在DEAB处理幼虫中，少量ENS细胞通常持续存在于前结肠。这种差异，在转录组水平上，证实了^ret在ENS形成中不可或缺的作用，而DEAB处理斑马鱼中部分ENS存在表明RA信号虽然关键，但允许某种程度的神经元分化和成熟。这一结果与先前发现一致，其中分化神经元在缺乏RA时似乎无法有效迁移或长期存活。重要的是，尽管RA抑制，5 dpf DEAB处理模型中^ret表达仍不受影响，可能导致ENS中观察到较不严重效应。另一方面，SCPs在两种模型中完全不受影响，表明这些细胞可能依赖替代通路或补偿机制，突出了它们用于ENS再生的潜力。

两种模型中还观察到非神经元细胞的显著影响，但大多数这些变化不同，突出了模型间肠道细胞景观的 distinct 差异。在^ret突变体中，免疫细胞增加与DEAB处理斑马鱼中减少形成对比，表明Ret和RA在免疫细胞分化和成熟中的不同作用。然而，两种模型均呈现与炎症信号通路相关基因下调，表明免疫反应能力共同受损。上皮细胞组成的改变进一步强调了两种模型的 distinct 特征。DEAB处理斑马鱼显示肠细胞和肠嗜铬细胞增加，而这些细胞在^ret突变体中减少。此外，^ret突变体中上皮细胞炎症通路上调指向易受炎症影响的 disruption 上皮层。然而，两种模型还显示^best4/otop2肠细胞和肠内分泌2细胞增加。这些细胞是最早在胎儿发育中出现的上皮细胞之一，并且已知与ENS相互作用。这种增加因此可能 serve 作为补偿机制，特别是在缺乏完全功能性ENS的情况下，以 preserve 肠道健康和功能。

在DEAB处理和^ret突变斑马鱼中还观察到ECM组成的显著变化，提示纤维化表型。虽然这一结果与先前研究一致，显示HSCR患者无神经节段中肌成纤维细胞数量增加以及更多表达^ACTA2的激活肌成纤维细胞，但这种增加在DEAB处理斑马鱼中似乎更明显。因此，ECM相关基因的转录变化可能表明与该模型相比^ret突变体中ECM重塑改变，强调了RA在维持ECM完整性中的重要性。

4 Discussion

本研究突出了5 dpf斑马鱼在RA抑制下跨肠道细胞群的转录组变化，为理解RA在肠道发育中的作用及其对HSCR研究的意义提供了宝贵见解。

4.1 The Crucial Role of RA in ENS Development

RA通过施加对^meis3和^ret上游通路的控制，对ENS发育至关重要，促进细胞迁移、分化和神经元存活。在我们研究中，DEAB处理斑马鱼中RA抑制导致全结肠无神经节症，scRNA-seq分析进一步证实除SCPs外所有ENS亚簇减少。可比发现见于Cre诱导小鼠模型，其中所有三个R