猪出生后暴露于氨环境对回肠肠神经系统的影响：神经可塑性、基因表达与健康关联研究

本文研究了猪场氨（NH3）暴露对回肠肠神经系统（ENS）的影响，发现高浓度NH3可诱导神经可塑性改变，上调胆碱乙酰转移酶（ChAT）和甘丙肽（GAL）基因表达，影响黏液层厚度与酸性黏蛋白比例，提示其与内脏疼痛和慢性腹泻相关，为动物健康与职业安全提供新见解。

　　

引言

集约化畜牧养殖占氨（NH₃）等气体总排放量的70%以上。为应对污染，欧盟引入了最佳可行技术（BAT），建议对设施、建筑和管理系统进行可持续改变。除了改善动物健康，BAT还能保障工人的安全环境，因为工作环境中高浓度的NH₃会导致呼吸系统和心血管疾病。粪污管理是影响环境中NH₃水平的主要因素之一。

一些研究表明，高浓度NH₃会降低猪的生产性能，这种恶化可能与采食量减少或因全身性不适或疾病导致的营养物质利用效率降低有关。此外，养猪场环境可能是动物胃肠道紊乱的风险因素。然而，环境及其潜在污染物与肠道相互作用的机制尚不清楚。最近的研究发现，NH₃具有神经毒性，可增加肉鸡神经细胞凋亡。此外，环境NH₃暴露会改变育肥猪空肠菌群，伴随中性粒细胞激活，导致肠道炎症。最新研究还强调了肠神经系统（ENS）与炎症相互作用对维持肠道稳态的重要性。

材料与方法

实验设计

研究选取了两个采用不同粪污处理系统的养猪场（循环系统RS和真空系统VS），分别对应高氨和低氨环境。整个生产周期被纳入研究，进行了粪便评分和粪便微生物学分析。屠宰后，采集12头猪的回肠样本，用于评估回肠形态和一些神经递质的表达。

农场环境

两个农场均被归类为集约化养殖，根据《污染综合防治指令》（IPPC，1996）的指示，饲养育肥猪以生产帕尔玛火腿。两个农场均采用“最佳可行技术”（BAT），通过建筑、设备和管理类型减轻NH₃浓度和排放。第一个农场采用地板下的循环系统（RS），第二个农场采用真空系统（VS）清除粪浆。

动物管理

两组动物均包括来自产房的新生仔猪。断奶后，仔猪被转移到育肥舍直至屠宰。遵循3R原则（替代、减少、优化），没有动物因实验目的被处死。猪只出于商业目的饲养，屠宰场收集回肠样本。米兰大学的动物福利组织被告知了收集废弃组织（如回肠）的事宜，符合国家法规要求。动物在屠宰前未接受药物治疗。农场兽医负责动物健康、福利和粪便评分，作为内部《危害分析与关键控制点》（HACCP）控制。

粪便评分和微生物学分析

每天对粪便质地评分：0分为成型/正常；1分为柔软/湿水泥状；2分为稀薄/水样；3分为黏液性腹泻；4分为血性腹泻。屠宰场采集结肠粪便样本，进行链球菌属、肠杆菌科（埃希菌属、沙门菌属）和乳杆菌属的细菌计数。微生物种群数据经对数转换，以log₁₀菌落形成单位（CFU）/克食糜表示。

回肠形态

组织学分析

石蜡切片（5微米厚）经苏木精-伊红（HE）染色以确定结构细节。使用光学显微镜获取图像，每个样本进行六次测量，评估派伊尔斑（PPs）的冠部、皮质（髓质周围）和髓质（最内层区域）面积占总面积的百分比。

组织化学分析

其他回肠切片进行染色以确定黏蛋白谱。采用阿尔新蓝8GX pH 2.5-高碘酸希夫（AB-PAS）序列染色，显示中性（PAS反应，紫色）和酸性（AB反应，蓝色）糖缀合物。使用光学显微镜获取图像，测定以下参数：黏液层厚度（每个样本15次测量的平均值）、杯状细胞占上皮面积的百分比（每个样本3张图片的平均比值）、酸性和中性细胞百分比（每个样本至少计数100个细胞，计算相对比值）。

双免疫荧光

其他回肠切片进行双免疫荧光以表征肠神经系统神经节，包括肌间神经丛和黏膜下神经丛。组织切片重新水化后，通过热诱导微波修复进行抗原修复，使用pH 6的柠檬酸盐缓冲液微波处理5分钟（500瓦），冷却两次。切片用磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）洗涤三次，并用Avidin-Biotin封闭试剂盒溶液处理。随后，切片与一抗1:200抗GFAP（胶质纤维酸性蛋白兔多克隆）在室温下孵育24小时。洗涤后，切片与10微克/毫升生物素化羊抗兔IgG在PBS中室温孵育2小时。然后，切片用10微克/毫升荧光素-Avidin D在0.1 M NaHCO₃（pH 8.5）和0.15 M NaCl中室温处理2小时。双免疫荧光第二步包括与一抗1:200抗PGP9.5在室温下孵育24小时。切片洗涤后与10微克/毫升生物素化羊抗鼠IgG室温孵育2小时，最后用10微克/毫升罗丹明-Avidin D在0.1 M NaHCO₃（pH 8.5）和0.15 M NaCl中18–20°C处理2小时。组织切片用含DAPI的Vectashield封片剂固定，使用共聚焦激光扫描显微镜检查。

图像分析使用ImageJ软件进行。所有测量的总面积为肠道横截面积。每个神经节被识别为对相应抗体免疫阳性的神经胶质细胞簇。计数回肠ENS黏膜下神经丛和肌间神经丛中每个神经节的免疫反应性神经元。评估所考虑区域的总神经节数，表示为总数/平方毫米。神经元和胶质细胞密度评估为免疫反应面积占所考虑总面积的百分比，以百分比表示。为评估神经元-胶质细胞相互作用，作者量化了神经密度/胶质密度比（PGP9.5/GFAP比）。

神经递质基因表达

RNA提取与cDNA合成

使用miRNeasy FFPE试剂盒从每个样本提取总RNA，洗脱体积为30微升无RNase水，并使用NanoDrop 8000分光光度计定量。通过二甲苯脱蜡去除样本中的石蜡，使其暴露于蛋白酶K，遵循制造商协议。500纳克RNA使用Quantitect逆转录试剂盒按照说明书逆转录为cDNA。通过DNase酶双重处理确保去除任何潜在基因组DNA污染。cDNA在?80°C保存直至后续使用。

基因表达谱

分析编码胆碱乙酰转移酶（ChAT）、甘丙肽（GAL）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的基因表达。以β-肌动蛋白（β-actin）作为参考基因。引物序列、退火温度和每个片段扩增大小见表1。使用iQ5实时PCR仪和Universal SYBR Green Supermix作为荧光分子进行定量实时PCR。所有基因的引物终浓度为250 nM。热循环条件为95°C 3分钟，随后40个循环的95°C 20秒和59°C 60秒（针对β-actin、ChAT和GAL基因），而95°C 3分钟和40个循环的95°C 15秒、55°C 15秒和72°C 30秒（针对iNOS基因）。包含熔解曲线。通过标准曲线法确定实时PCR效率。测定每个样本的循环阈值（Ct值）并使用β-actin基因作为内参进行标准化。使用ΔΔCt法计算对照组和处理组样本的相对基因表达，并与作为校准器的对照组样本之一进行比较。

统计分