一种营养优化培养基促进Chromochloris zofingiensis快速生长与三酰甘油高效积累的机制研究

本刊推荐：本研究通过离子组学(ionomics)技术，开发了Chromochloris zofingiensis专用优化培养基(CORE)，该培养基在添加葡萄糖(+Glc)条件下可维持至少5天的营养充足状态，显著提升生物量(22.5%培养物体积占比)和三酰甘油(TAG)积累(提高3.8倍)。研究证实混合营养生长对磷(P)和硫(S)需求显著，并通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)验证铁(Fe)是唯一胞内浓度与外界浓度正相关的元素。该培养基为微藻生物燃料和虾青素(astaxanthin)的产业化生产提供了标准化实验方案。

　　

引言

随着全球对能源和产品需求的增长，微藻作为可持续生物经济组分备受关注。某些藻类在混合营养条件下可同步积累生物量和三酰甘油(TAG)，其中Chromochloris zofingiensis（ Chromochloris?zofingiensis ）因能同时产生生物燃料前体和高端抗氧化剂虾青素(astaxanthin)而具有重要经济价值。该藻株已成为光合作用、代谢和生物生产研究的新兴模式生物，但其标准化培养基的缺失限制了实验可重复性。鉴于葡萄糖处理(+Glc)与矿物质缺乏的相互作用会影响光合作用、生长及脂质合成，本研究旨在基于C.?zofingiensis细胞离子组(ionome)设计营养充足的优化培养基。

葡萄糖驱动快速生长与高生物量积累但需更多矿物质营养

研究团队首先在ADJ基础培养基（Bristol培养基改良版）上进行测试，发现+Glc使对数生长期倍增时间缩短至15.65±0.15小时（无Glc对照组为22.91±0.14小时），细胞直径从4.8±0.04μm增大至9.4±0.07μm。通过每日葡萄糖补料实验证实，持续供糖可使培养物细胞体积占比达22.5%，表明高密度藻浆培养具有工业化潜力。

鉴定C.?zofingiensis细胞的元素比例

通过ICP-MS测定无Glc和+Glc条件下细胞元素组成，发现+Glc细胞中多数矿物质营养浓度显著降低（磷P、钼Mo、硒Se除外），这可能是由于碳密集的淀粉和脂质积累占据了细胞空间。值得注意的是，钙(Ca)需求远低于其他光合生物，而无Glc细胞中铁(Fe)浓度（1.79±0.068×10⁶ atoms μm^-3）反而高于钙（0.52±0.075×10⁶ atoms μm^-3），这与莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的元素分布模式截然不同。

优化营养比例改善葡萄糖饲喂生长

研究团队基于不同生长阶段生物量设计了三组培养基：P14（光自养静止期）、M10（混合营养第10天）和M14（混合营养第14天）。实验发现最高营养的M14培养基会抑制无Glc生长（倍增时间28.0±0.55小时），而最低营养的P14培养基则无法支持+Glc最大生长（倍增时间19.7±0.35小时）。M10培养基在两种营养状态下均表现最优，其磷硫消耗率（25% P和9% S）显著低于ADJ培养基（73% P和25% S），表明其能更好地维持营养充足状态。

优化pH、氮、钾和钠以提高可重复性

pH测试显示培养基pH≥7.0时生物量积累最佳（21.14±0.59×10⁷ μm³ mL^-1），最终选择HEPES缓冲体系维持pH7.5。氮源实验证实该藻无法在≥22.5 mM NH₄Cl条件下生长，故将硝酸钠(NaNO₃)浓度提升至45 mM。钾钠比例测试（1:5至5:1）对生长速率无显著影响，因此培养基采用单一钠源和钾源简化配方。

调整铁浓度实现对数生长期离子组稳定性

通过81个无Glc样本的离子组数据分析发现，铁是唯一胞内浓度与外界浓度呈正相关的元素（线性模型斜率0.501 mmol (mol S)^-1/μM，p=7.34×10^-5）。将铁浓度从200 μM降至50 μM后，对数生长期所有元素（包括铁）均保持稳定浓度，且不影响生长速率。这一调整最终形成了Chromochloris优化元素比例(CORE)培养基。

CORE培养基提升生物量与脂质生产力

与传统Proteose培养基相比，CORE+Glc培养96小时后生物量提高4.2倍，总脂肪酸甲酯(FAME)产量提升2.9倍，TAG特征脂肪酸含量提高3.8倍。高效液相色谱(HPLC)分析显示两种培养基虾青素产量相近，但CORE+Glc细胞因叶绿素含量更高而保持绿色，说明在高营养状态下仍能诱导虾青素合成。

讨论

CORE培养基基于离子组学设计，既能满足+Glc培养5天的营养需求，又可避免营养毒性。研究发现在+Glc条件下硫磷需求显著增加，可能与葡萄糖激活的含硫辅酶A生物合成和磷酸化代谢途径有关。铁元素的特殊积累模式与莱茵衣藻相似，提示其在光照应激研究中需特别注意。该培养基策略不仅为实验室研究提供标准化方案，还可应用于工业场景中的营养成本优化，特别是利用制糖废料等碳源进行规模化生产。研究表明CORE培养基也适用于其他高生物量微藻（如Auxenochlorella sp. UTEX 250-A），为藻类生物制品开发提供了通用技术平台。

实验方法

培养基在Bristol基础配方上调整，微量金属元素参照Kropat等人方法与Na₂-EDTA螯合。最终CORE培养基包含45 mM NaNO₃、2.5 mM MgSO₄、1.5 mM K₂SO₄、0.08 mM CaCl₂、5.7 mM K₂HPO₄和0.3 mM KH₂PO₄，微量金属元素包括50 μM Fe-EDTA、15 μM Mn-EDTA、12 μM Cu-EDTA和17.5 μM Zn-EDTA。培养条件为100 μmol photons m^-2 s^-1持续光照、150 rpm振荡、25°C。葡萄糖浓度采用Megazyme酶法试剂盒测定，元素含量通过ICP-MS/MS分析，脂质提取采用氯仿:甲醇(含0.01% BHT)法，TAG通过薄层色谱(TLC)分析，脂肪酸甲酯通过气相色谱-火焰离子化检测器(GC-FID)定量，色素采用C30反相柱HPLC分离鉴定。统计采用Welch t检验、单因素方差分析和线性模型。