术中生物打印技术促进大鼠和绵羊颅颌面骨再生修复的研究

本研究开发了一种创新的胶原基生物墨水（HC-ink），通过术中生物打印（IOB）技术成功修复了大鼠和绵羊的颅骨缺损。该生物墨水具有优异的热交联特性、生物相容性和成骨诱导能力，结合3轴生物打印机和6轴机械臂，实现了小动物（30秒/缺陷）和大动物（5分钟/缺陷）的高精度原位修复。研究证实，含有人脂肪源性干细胞（hADSCs）或骨形态发生蛋白-2（BMP-2）的HC-ink能显著促进骨再生（大鼠8周达90%骨覆盖，绵羊12周达80%骨覆盖），并显著改善力学性能（杨氏模量、峰值力和能量分别提升240%、235%和358%），展现了IOB技术在自动化手术干预中的转化潜力。

　　

物理特性与生物相容性：HT墨水与HC墨水的比较研究

研究团队对硬组织墨水（HT-ink）和高浓度胶原墨水（HC-ink）进行了系统的物理表征。两种墨水均以壳聚糖、β-甘油磷酸二钠盐水合物（β-GP）、纳米羟基磷灰石粉末（nHAp）和胶原蛋白为主要成分，但HC-ink中的胶原浓度更高（66 mg mL^-1，溶解状态），而HT-ink为40 mg mL^-1（分散状态）。通过衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）确认了各组分的特征峰，包括酰胺I带（1650 cm^-1）、酰胺II带（1550 cm^-1）以及PO₄的内部振动（900–1200 cm^-1和500–620 cm^-1）。

两种墨水均表现出合理的可打印性（打印比P_r：HT-ink为1.2±0.3，HC-ink为1.1±0.1），能够复制大鼠颅骨骨的同心结构。杨氏模量相近（HT-ink为5±0.2 kPa，HC-ink为6±1 kPa）。在溶胀实验中，HC-ink组在1小时内吸收液体达到平台期，而HT-ink组的侵蚀效应更为明显。在降解行为方面，在DPBS中37°C下培养8周，HT-ink组完全降解，而HC-ink组保留了约40%的构建结构，表明其具有更长的耐久性。在胶原酶溶液中，两组均在4周内完全降解，表明在体内生理条件下，生物墨水基质可能在植入后4周内通过细胞活动和宿主组织相互作用进行重塑。

加入细胞后，墨水的流变特性发生变化。将500万人脂肪源性干细胞（hADSCs）加入HT-ink和HC-ink（分别称为HT-5M和HC-5M）后，HC-only表现出更高的粘度（η），两种生物墨水均表现出剪切稀化行为。振幅扫描显示，在较低应变下，储能模量（G′）占主导地位，表明墨水呈现类固体（弹性）行为。HC-only的G′（1207 Pa）显著高于HT-only（352 Pa），表明其具有更高的弹性强度。加入5M hADSCs mL^-1后，HT-ink和HC-ink的G′分别降至174 Pa和627 Pa。所有生物墨水在较高应变值下G′降低，并在各自的G′–G″交叉点（G′ = G″）屈服，证实它们具有屈服应力行为。HC-only的屈服应力（1.1 Pa）显著高于HT-only（0.5 Pa）。加入5M hADSCs mL^-1后，HT-only和HC-only的屈服应力分别降低了约60%和85%，但HC-5M的G′仍显著高于HT-5M。这表明HC-ink中溶解的胶原使其更均匀，具有增强的凝胶样特性，从而在生物打印过程中提供一致性和更好的结构稳定性。频率扫描测试显示，G′高于G″，表明HT-only和HC-only在所有频率下均保持在稳定的弹性区域。HC-only的值显著高于HT-only。复数粘度（η*）随频率增加而降低，证实了生物墨水的假塑性，有利于挤出式生物打印（EBB）。

细胞相容性与成骨分化：生物打印hADSCs的评估

通过活/死染色评估生物墨水的细胞相容性。将细胞负载的生物墨水打印成块状构建体，结果显示所有样本在14天培养期间细胞存活率均超过90%，且细胞存活率随时间增加。这些结果表明，生物打印的构建体具有细胞相容性，可用于体外和体内应用。

为了评估hADSCs的成骨分化，将细胞以不同密度打印成3D网格图案，构建体中的细胞数量分别为0.9×10⁵、4.4×10⁵和8.8×10⁵个（对应生物墨水中的细胞密度为1、5和10M hADSCs mL^-1）。通过免疫荧光染色观察RUNX2（绿色）、BSP（青色）和Phalloidin（红色），并用DAPI（蓝色）复染。RUNX2是成骨活性启动阶段的关键转录因子，而BSP在成熟骨中高表达，可作为矿化骨基质沉积的指标。无细胞构建体未显示荧光信号，而HC-ink构建体从第14天到第28天显示RUNX2表达减少和BSP表达增强。通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）在第28天评估成骨基因标志物。I型胶原（Col1）是骨细胞外基质的主要成分，是另一个关键的早期成骨标志物，可验证细胞的成骨潜力。Osterix是一种在膜内骨形成和矿化中起作用的转录因子。所有基因表达（Col1、RUNX2、osterix和BSP）在HC-ink组中均上调。尽管RUNX2是早期成骨标志物，但此处观察到的持续高水平可能反映了其在促进成骨细胞分化中的积极作用，通常通过诱导下游标志物如osterix和BSP来实现。这些发现表明HC-ink更适合诱导成骨活动。

大鼠颅骨缺损的术中生物打印：从技术实现到再生效果

在全面表征HC-ink的体外性能后，在手术环境中进行了术中生物打印（IOB）。在大鼠头骨上手术创建两个临界尺寸的颅骨缺损（直径5 mm，厚度2 mm）。使用3轴生物打印机将解剖学精确的骨构建体直接打印到缺损处，使用不同细胞密度的生物墨水。圆柱形构建体以螺旋路径打印，填充密度为100%，每个构建体约需30秒。该动物实验共研究了10组，包括空白对照组、含rhBMP-2的HC-ink组、含0、1和5M hADSCs mL^-1的HT-ink组、含0、1、5和10M hADSCs mL^-1的HC-ink组以及Bio-Oss组。手术后第4周通过活体微型计算机断层扫描（μCT）评估缺损部位，并在第8周处死大鼠进行进一步评估。

代表性μCT图像显示，IOB后4周和8周再生的硬骨（300 mgHA ccm）呈蓝色。大体图像表明，从空白组到HC-ink组，以及从第4周到第8周，骨生长逐渐增加。第4周和第8周的新骨体积与总体积的百分比（BV/TV）显示，在HT-ink中加入hADSCs不利于新骨形成，随着细胞密度增加呈下降趋势。这可能是由于流变稀释和细胞诱导的胶原酶活性导致HT-ink快速降解。相反，由于HC-ink中胶原含量更高且呈溶解状态，hADSCs促进了骨形成。虽然Bio-Oss组显示再生的骨体积最高，但rhBMP-2组与HT-ink或HC-ink组无差异。同样，标准化骨矿化密度（BMD）在Bio-Oss组第4周和第8周最高。然而，随着时间的推移，尤其是HC-ink组，BMD逐渐增加。骨覆盖面积（%）在HT-ink组（除HT-5M组外）和所有HC-ink组中均显著高于空白组。有趣的是，含细胞的HC-ink组在第8周显示缺损处均匀分散的硬组织碎片。然而，Bio-Oss组观察到非特异性颗粒分布，而含hADSCs的HT-ink组骨覆盖面积减少，与BV/TV结果一致。使用μCT数据集评估骨桥接评分，作为再生骨形态的指标，评分从0（无骨形成）到4（最长点（5 mm）处完全骨桥接）。结果显示，HC-10M组评分最高（3.4±0.6），显著高于空白组（2.3±0.5）或HT-5M组（2.1±0.2）。这些结果表明，增加HC-ink中的细胞密度可增强骨再生。

为了确认细胞负载和术后命运，用串联二聚体番茄（tdTomato；红色）慢病毒转导hADSCs，并以10M mL^-1加入HC-ink。IOB后2周，取大鼠颅骨进行RUNX2（绿色）染色以评估骨分化。值得注意的是，tdTomato⁺ hADSCs稀疏分布在缺损处，红色和绿色荧光逐渐重叠，表明hADSCs向成骨谱系转变。同样，组织学染色也描述了缺损处骨再生的进展。hADSCs显示出随时间推移承诺和贡献于成骨过程的潜力。确实，追踪hADSCs直至成熟骨重塑对于理解外源性hADSCs的作用并将其与参与骨再生的内源性细胞区分开来很有价值。然而，正如我们之前的研究所承认的，tdTomato的荧光寿命迅速减少，可能是由于细胞增殖、有丝分裂事件和细胞间相互作用等因素。因此，荧光较少不仅可以理解为细胞死亡，还可以理解为代谢活动、分化以及与宿主组织的相互作用；这些挑战应在未来研究中解决，以实现骨再生过程中的持续追踪。

通过苏木精和伊红（H&E）和Masson三色染色（MTS）进行组织学分析以评估骨再生。在H&E图像中，天然骨（NB）显示强烈的伊红（红色）染色，而再生骨（RB）则较浅，软组织（ST）呈粉红色。详细来说，空白组显示清晰的软组织桥接和某些区域的新周边骨。与空白组相比，HT-ink和HC-ink组在ST层下方显示出更高的RB组织。与μCT数据一致，HT-ink组显示随着细胞密度降低，RB组织更厚。HC-ink在最高细胞密度下形成更厚且强烈红色（表明更成熟）的骨结构，细胞密度超过5M cells mL^-1时观察到骨碎片形成的开始。同时，含rhBMP-2的HC-ink显示骨再生与HC-only和HC-1M组相当。在所有组中，Bio-Oss组代表更厚的RB层和强烈的红色，尽管RB延伸超出缺损部位，表明异位骨形成。同样，MTS将胶原染成浅蓝色，显示空白组、rhBMP-2组和HT-ink组未成熟骨形成。相反，HC-ink和Bio-Oss组中观察到的组织厚度增加显示灰色或红色染色，表明 ongoing ossification。

此外，进行组织学评分以进行定量评估。累计评分通过评估骨-支架界面质量（称为界面）、缺损内骨或纤维组织形成和炎症反应（称为孔组织）以及骨形成量（称为骨形成）获得。这些参数评分从0（最低）到4（最高）。有趣的是，rhBMP-2、HT-only、-1M和-5M的累计评分分别为6.4、4.5、6.2和9。这里，一些评分参数与空白组（4.2）相似。同时，所有HC-ink组均显示显著改善的组织学评分，即HC-only为9，HC-1M为6.7，HC-5M为9.3，HC-10M为10.7，而Bio-Oss评分为9.3。此外，通过成骨标志物（RUNX2）的免疫组织化学（IHC）染色评估骨形成。RUNX2是早期骨重塑阶段的代表性标志物，积极参与各种过程，如前成骨细胞聚集、分化为破骨细胞和基质生产。确实，在一些组中（包括HC-1、-5和10M）观察到更明显的RUNX2表达，与空白组相比显著更高。这些IHC表征证实了加入hADSCs的HC-ink更有效地促进骨再生。

此外，评估机械强度以评估新骨的强度和功能。推出测试数据用于分析标准化BMD、杨氏模量、峰值力和能量。边界BMD的测量允许获得特定于硬骨的BMD，从而能够计算骨强度。结果显示，HC-10M组在各组中BMD最高。HC-10M的杨氏模量和峰值力显示最高值，与空白组相比分别提高2.7倍（杨氏模量）和1.7倍（峰值力）。与这些特性一致，最大负载点的能量吸收在HC-10M中比空白组高2.4倍。HC-10M的结果与Bio-Oss组无统计学差异，Bio-Oss组与空白组相比显示杨氏模量提高6.0倍，峰值力提高2.0倍，能量提高2.4倍。这些发现表明，沉积具有最高细胞浓度的HC-ink导致形成相对坚硬的骨。在成功应用IOB重建小动物模型颅骨缺损后，进一步在大型动物模型上验证了IOB。

绵羊颅骨缺损的术中生物打印：技术升级与大规模应用

通过使用6轴机械臂演示了绵羊颅骨缺损模型中的IOB实施。使用具有两个隔室（上隔室：直径14 mm，厚度6 mm；下隔室：直径11 mm，厚度3 mm）的颅骨穿孔器在绵羊头骨上生成四个缺损。6轴机械臂以降低的速度300 mm/min操作，以确保彻底填充两个圆柱形隔室，每个缺损完全填充约需5分钟。绵羊在第12周处死以评估骨再生。绵羊研究设三组：空白组、HC-only组和加载重组人BMP-2（HC-rhBMP-2）的HC-ink组（每缺损30 μg）。排除hADSCs以防止异种免疫反应，但添加了临床可用的生长因子rhBMP-2以支持骨生长。

重建的μCT图像显示再生的骨呈蓝色，BMD超过300 mgHA ccm^-1。空白组仅在周边区域产生骨再生，而HC-only和HC-rhBMP-2组在中尖区域也显示新骨形成。虽然BV/TV在各组之间无显著差异，但HC-only和HC-rhBMP-2组的BV/TV分别比空白组高1.5倍和1.7倍。HC-rhBMP-2组的标准化BMD增强（33±17%），其次是HC-only组（22±8%）和空白组（19±6%）。此外，生物打印组的骨覆盖面积达到约80%，而空白组显示约50%。最后，骨桥接评分在0（无骨形成）到4（最长点处完全桥接整个跨度）的范围内进行评估。正如预期，HC-rhBMP-2组显示最高评分3.8±0.2，而HC-only和空白组分别为2.9±0.5和2.0±0.6。这些结果表明，HC-ink和rhBMP-2的组合显著增强了骨再生。

还在不同深度（对应缺损厚度，从边缘3 mm到中心区域9 mm）进行了组织学分析。H&E染色图像显示，缺损区域向中心尺寸增加。空白组和HC-only组的缺损区域发现多孔或纤维形态特征。然而，HC-rhBMP-2中的缺损区域与众不同， identified with densely packed structures。为了通过MTS进一步理解再生过程，我们观察到空白组缺损表面致密的骨边界，显示强烈的蓝色。同时，在HC-only和HC-rhBMP-2组的缺损区域识别出新骨结构，显示蓝红色，蓝色表示再生骨，红色表示成熟骨。特别是，红色区域在HC-rhBMP-2的缺损区域占主导。在骨重塑过程中，可以观察到紧密堆积但随机组织的束，称为编织骨。这些结构由无序排列的胶原纤维束、大量骨细胞和不规则多孔区域组成，其中发生钙化或腔隙重塑。随后，MTS图像显示出与H&E图像相似的形态特征。然而，可能需要额外的见解来全面理解骨成熟度。基于这些，HC-rhBMP-2组揭示了最有利于新骨和成熟骨形成的条件。

此外，通过组织学进行定性和定量分析以解释骨再生。MTS可视化不同深度（边缘、周边和中心）的缺损区域。空白组和HC-rhBMP-2组显示相似的轮廓，缺损区域尺寸增大，从边缘到中心没有明显的颜色变化。相反，HC-only组显示颜色从红色变为蓝色。详细来说，空白组持续显示蓝色缺损区域，表明未成熟骨形成。相比之下，HC-only组在周边区域显示骨成熟呈红色，而中心区域显示红蓝色混合，表明 ongoing bone maturation。向HC-ink添加rhBMP-2加速了骨成熟，如HC-rhBMP-2组中观察到的持久红色所证明。这些结果表明HC-ink对骨再生的积极影响，并证明引入生物活性线索（如rhBMP-2）后疗效显著改善。此外，使用评分系统定量评估骨形成的进展。骨-支架界面、支架孔内的硬组织反应以及缺损内的骨形成进行了评估。这些从三个区域（边缘、周边和中心）集体表示，评分从0到12。骨-支架界面评分对所有组均为中等，因为生物墨水的生物相容性和足够的机械强度既不会引起免疫反应，也不会引起过度的剪切应力。平均评分空白组为1.9±0.9，HT-only组为2.7±0.6，HC-rhBMP-2组为3.5±0.5。虽然纤维组织形成或腔隙重塑没有扩展到整个区域，但在HC-only和HC-rhBMP-2组中观察到重塑进展。孔组织评分指示组织的组成，如骨、纤维组织或炎症细胞。对于孔组织表征，最高分4表示 mostly bone的结构，而最低分0表示填充炎症细胞而无骨存在的组织。孔组织的平均值空白组为1.8±0.8，HC-only组为2.2±0.8，HC-rhBMP-2组为2.7±0.5。HC-rhBMP-2显示最高评分，因为它填充了未成熟骨或纤维组织，而其他组的缺损区域 mostly fibrous。最后，骨形成评分从0（0%骨体积）到4（75–100%骨体积）， incremental step of 25%。评分空白组为1.6±0.8，HC-only组为2.3±1.1，HC-rhBMP-2组为2.8±0.4。这与之前的数据一致，即HC-rhBMP-2提供了有利于新骨形成和成熟的微环境。组织形态计量评估表明HC-rhBMP-2对骨再生有希望，通过机械测试进一步评估。

机械测试设置开发了针对绵羊颅骨缺损的探针（直径10 mm）和带孔板（直径12.5 mm）（上隔室直径14 mm；下隔室直径11 mm）。对于杨氏模量和峰值力，HC-rhBMP-2组（137±21 MPa和1819±266 N）与空白组（57±20 MPa和774±396 N）显示显著差异。同时，HC-only组显示101.0±38.6 MPa和1129±362 N，与空白组或HC-rhBMP-2组无显著差异。此外，HC-rhBMP-2组通过耐受更多能量显示最高负载承载能力（2988±1046 Nmm），与空白组（1394±886 Nmm）和HC-only组（835±288 Nmm）相比分别提高3.6倍和2.1倍。这些结果强调，补充rhBMP-2的HC-ink不仅促进骨再生，还改善了再生骨的机械性能。

讨论与展望：IOB技术的临床转化前景

IOB用于颅骨骨再生的成功很大程度上取决于生物墨水的有效性，包括其生物相容性、可加工性、骨诱导性、骨传导性和骨整合性。对于IOB方法，引入了GelMA和低浓度胶原（即2 mg mL^-1），但使用UV光交联或低机械强度引起了对其适用于大体积缺损重建的担忧。考虑到这些因素，开发了HT-ink，包含胶原（66 mg mL^-1）补充nHAp，提供与原代大鼠骨髓干细胞（BMSCs）的生物相容性、热交联能力和连续挤出性。然而，通过IOB加入细胞的功效仍然不确定，由于HT-ink的流变和降解特性的改变。为了克服这些限制，在本研究中，我们通过增加胶原含量来推进HT-ink，以减轻机械性能的损失并改善物理稳定性。随着稳定的挤出性、改进的储能模量和高生物相容性的建立，我们进行了全面的体外和体内效应分析，重点关注成骨活动。为了诱导成骨，使用hADSCs有多种原因。hADSCs由于其丰富和易于收获而被广泛选择用于临床前研究。此外，当与胶原和nHAp结合时，hADSCs显示出向成骨谱系分化的能力。基于这些因素，hADSCs对于骨组织重建非常有利。

体外研究证明了配制的HC-ink用于EBB和骨再生的可行性。通过精确调节HT-ink和HC-ink实现了稳定的挤出性，即使胶原浓度从40 mg mL^-1（分散状态）到66 mg mL^-1（溶解状态）变化。加入hADSCs后，两种生物墨水均保持高细胞存活率超过90%，但成骨活动不同。具体来说，HC-10M通过qRT-PCR在第28天导致更高的Col1和BSP表达，表明其在体内应用时加速成骨的潜力。相反，HT-1M和-5M导致成骨基因表达下调 compared to those of the HC-ink。基于此，我们继续进行体内研究HC-ink。

在两种不同动物模型中使用不同生物墨水组合的基本原理基于科学和转化考虑。在大鼠模型中，我们将hADSCs加入生物墨水中以证明IOB的可行性和再生潜力。这种小动物模型允许我们评估细胞负载构建体的生物学性能，并为未来使用干细胞工程复合组织（如血管化或软硬界面构建体）建立关键的基础概念证明。相反，对于大型动物（绵羊）模型，我们 intentionally excluded cells from the bioink to avoid potential xenogeneic immune responses。 Such immune reactions could introduce confounding variables, making it difficult to isolate and assess the performance of the bioink material itself。该模型旨在评估生物打印构建体的可扩展性、手术处理和结构保真度在临床相关环境中。通过专注于无细胞打印，我们旨在强调该技术用于生成患者特异性、厘米级具有复杂几何形状的构建体的转化潜力。

为了减轻免疫反应，选择了T细胞缺陷的RNU无胸腺大鼠；这些动物先前已显示当注射人BMSC负载的水凝胶时促进骨愈合， exhibit nonlymphocyte morphology与免疫活性Sprague Dawley大鼠相比。在各种可用于评估骨再生策略的啮齿动物骨骼中，大鼠颅骨作为一个 established, reproducible, and versatile option。虽然它经历最小的生物力学负载，但其一致的解剖结构和易于手术访问使其成为系统评估生物墨水性能的理想选择， without the confounding variables introduced by fixation hardware or complex mechanical environments。这使得该部位成为评估生物墨水功效的理想平台，并为开发复杂组织（如血管化骨或软硬复合材料）提供稳定平台。虽然更具几何复杂性的模型（如下颌缺损）确实有价值，但颅骨模型作为验证生物墨水配方、可打印性和体内生物学性能的关键第一步，即使在大型动物模型上也是如此。这里获得的见解为未来在更具机械和解剖要求高的模型中的研究奠定了基础。此外，虽然每只大鼠单个8 mm缺损已在文献中广泛使用，但每只大鼠两个5 mm缺损也作为临界缺损尺寸，不允许自发愈合，如许多研究所述。

在这项工作中，动物研究在大鼠和绵羊上进行，大鼠是CMF重建中最常用的模型之一，而绵羊是最不常用的模型，根据 over 600 studies。然而，当考虑通过自动化平台进行IOB时，报告的案例变得罕见， due to challenges of ensuring biocompatibility, printability, time efficiency, and a convenient setup suitable for surgical settings。报告的绵羊颅骨缺损以各种尺寸和形状创建，但具有可比较的体积。例如，方形缺损（35×35×3 mm）、两个方形缺损（20×20×5 mm）和四个圆柱形缺损（10 mm直径×20 mm厚度）总体积分别为4000、3675和3142 mm³，与本研究中创建的四个 countersunk-shaped defects（4835 mm³）相似。此外，在大型动物模型中应用IOB带来复杂形状、复杂程序和大体积生物材料需求的挑战。因此，这项研究是最早尝试将IOB纳入并彻底分析小型和大型动物模型的之一。具体来说，该方法整合了生物墨水配方和IOB优化，使用3轴生物打印机用于大鼠和6轴机械臂用于绵羊。虽然3轴生物打印机有效，但它通常缺乏在非平面表面上精确3D开发所需的自由度（灵活性）。相比之下，选择6轴机械臂是因为它能够简化程序、生成复杂形状的构建体、促进实时定制，以及其促进大体积在大型受试者上的能力。

多项研究探索了通过IOB进行CMF重建。例如，使用激光生物打印机、3轴生物打印机（EBB）或机械臂（EBB）采用不同的生物打印方法来治疗大鼠颅骨缺损， achieving BV/TV of ≈13% at Week 8, ≈26% at Week 6, and ≈30% at Week 6, respectively。我们的研究相比，实现了BV/TV比率约36%在第8周， notably with a ≈90% bone coverage area and significant mechanical integration。 Also, among studies utilizing IOB via various bioprinting modalities, they primarily provide BV/TV values, which limit comparisons across various aspects。对于绵羊颅骨缺损，报告了注射和植入。这突出了对IOB进行全面调查的必要性，包括彻底的术后评估，如μCT成像、机械测试和组织学检查，如本研究所述。

此外，证明了大鼠中不同细胞密度下骨再生效力的影响。具体来说，HC-ink显示骨再生功效改善，细胞密度增加至10M mL^-1。简而言之，HC-10M组在第8周实现骨覆盖面积约90%。随后，在小型动物模型中评估了HC-rhBMP-2，以比较其与hADSC负载的HC-ink的功效。简要来说，HC-rhBMP-2显示与HC-only组相当的结果，但在BMD、骨桥接和RUNX2表达方面不如hADSC负载的HC-ink组有效。这可以进一步用文献阐述。当用BMP-2、phenamil（激活BMP信号通路的分子）或BMP-2+phenamil涂层聚乳酸-共-乙醇酸（PLLA）构建体测试时，BMP-2+phenamil组合诱导体外成骨分化。植入6周后，phenamil+BMP-2组合显著增强小鼠颅骨再生