氨水预处理杨木废液中酚类化合物的生物转化：工程化芳香烃杆菌（Novosphingobium aromaticivorans）将p-羟基苯甲酰胺和p-羟基苯甲酸转化为生物塑料前体PDC

本文推荐了一项关于木质纤维素生物质精炼过程中废液资源化利用的创新研究。研究团队通过氨水预处理杨木，发现废液中主要酚类成分为p-羟基苯甲酰胺(pHBAm)、p-羟基苯甲酸(pHBA)和苯酚，并首次证实工程化芳香烃杆菌( N. aromaticivorans )能够将pHBAm和pHBA高效转化为生物塑料前体2-吡喃酮-4,6-二羧酸(PDC)，为生物质废液的增值化利用提供了新策略。

　　

引言

开发从生物质等可再生资源生产材料、化学品和燃料的策略对于促进生物经济发展和减少因无限制使用化石燃料导致的长期气候变化至关重要。生物质预处理可以改变细胞壁结构，提取矿物质，（部分）去除木质素、半纤维素和微生物毒素，并促进解构的下游步骤以回收储存在纤维素聚合物中的碳水化合物。这些改变共同释放了生物质的潜力，使预处理成为生物质转化为生物燃料和可再生化学品的关键步骤。

各种生物质预处理方法已被研究，重点关注预处理对生物质性质和生物质转化为生物燃料（如生物乙醇、正丁醇和异丁醇以及生物柴油）的影响，改善和优化酶消化时的糖产量（如葡萄糖和木糖），以及确定和随后去除微生物发酵的抑制剂。氨预处理是一种广泛研究的预处理方法，已知可以改变和去除木质素，解晶纤维素，并增加生物质中的可及表面积。

生物质预处理通常会产生含有溶解碳水化合物和芳香族化合物的废液流。例如，酸性亚硫酸盐预处理（SPORL）的废液可以溶解木材中高达25wt%的原始固体。能量甘蔗渣的氨水预处理可以去除26-44wt%的原始固体。因此，废液在释放到环境之前需要进行适当处理。研究人员探索了将废液用于后续生物质预处理和发酵培养基制备，这可以节约水、化学品和能源。另一种策略是利用废液中的有机物制造其他有价值的化学品。各种过程的废液已被生物或热化学转化为聚羟基链烷酸酯、生物柴油、氢气、沼气、有机酸（如琥珀酸）、芳香族化合物（如儿茶酚和芳香烃）和生物油，用于燃料、化学品和聚合物应用。氨预处理后废液的增值化研究较少，尽管溶解的芳香族化合物可能是制造平台化学品、聚合物和药物的宝贵原料。

然而，这些溶解的酚类物质，通常被称为“木质素碎片”，由于废液价值低且化学复杂性高，其特征尚未得到充分表征。由于酯连接的p-羟基苯甲酸酯（pHB-酯）存在于杨树、柳树和棕榈树的天然木质素中，使用温和的碱性条件可以从中产生p-羟基苯甲酸（pHBA）。在高温（>100°C）下对杨木进行氨水预处理时，木质素结合的pHB-酯优先形成p-羟基苯甲酰胺（pHBAm），而不是通过酯键水解形成pHBA，然后pHBA可以通过脱羧进一步降解为苯酚。苯酚已被报道存在于混合山毛榉、杨木、橡木和栗木的碱性制浆（165-170°C）的黑液中。苯酚也通过碱性水热处理在250-400°C下从技术木质素合成。为了更好地理解氨预处理杨木的废液并利用它，需要对其溶解的芳香族化合物进行详细表征。

金属已被用作木质素降解、废液处理和生物质预处理的催化剂。重金属已知可加速木质素模型的碱性过氧化氢氧化数十年。铜催化的碱性过氧化氢氧化可以几乎完全（99%）去除橄榄油厂废水中的多酚。铜(II) 2,2'-联吡啶催化的碱性过氧化氢（Cu-AHP）预处理被发现大大提高了后续酶解植物细胞壁的单糖产量，适用于所有生物质类型。金属（例如Na、Li、Ba、Cu、Pd、Au、Ag、Rh和Fe/Ru）也可以在广泛条件下催化羧酸的脱羧。在这个意义上，金属对氨预处理的影响引起了极大兴趣。

预处理后，将木质纤维素生物质生物转化为生物燃料（如生物乙醇、正丁醇和异丁醇以及生物柴油）和平台化学品（如聚羟基链烷酸酯和顺,顺-粘康酸）为生物经济提供了可及的途径。生物转化相对于化学转化的优势通常包括使用水性系统进行反应，较低的操作温度和压力，以及在物理和环境更安全的条件下操作。一个这样的生物转化平台将生物质木质素衍生的酚类化合物转化为2-吡喃酮-4,6-二羧酸（PDC），这是一种用于生物塑料和环氧粘合剂的潜在聚合物前体，这最初由Masai等人开创。PDC的生产已经在几个微生物底盘中进行研究，包括假单胞菌属、少动鞘氨醇单胞菌SYK-6、大肠杆菌和芳香烃杆菌PDC菌株。在这些底盘菌中，芳香烃杆菌PDC菌株天然编码将三种主要类型的木质素衍生酚类化合物，即芥子基（S）、松柏基（G）和对香豆基（H）衍生物，转化为PDC的酶，使其成为一种研究工具，能够量化从生物质加工的各种流中可能转化为PDC的酚类物质，例如来自氨水预处理的废液。

在本研究中，杨木片用氨水预处理，并测试了金属添加剂的影响。酚类物质用乙酸乙酯从废液中萃取，主要酚类物质被鉴定为苯酚、pHBAm和pHBA。使用芳香烃杆菌PDC菌株对这些酚类物质进行生物转化表明，pHBAm和pHBA成功转化为PDC，使酚酰胺成为芳香烃杆菌平台的新原料。苯酚未被芳香烃杆菌转化为PDC，并且不抑制pHBAm和pHBA向PDC的生物转化。

实验部分

材料与化学品

杨木片（风干，约5毫米颗粒大小，去皮NM6杨木，2018年收获）由威斯康星大学麦迪逊分校的五大湖生物能源研究中心（GLBRC）提供。2-吡喃酮-4,6-二羧酸（PDC）标准品是通过先前描述的方法从pHBA生物合成的，使用工程化的芳香烃杆菌DSM12444（PDC菌株）在转化植物衍生酚类时积累PDC。该PDC菌株在ligI (Saro_2819或最新注释中的SARO_RS14300)、desC (Saro_2864或SARO_RS14525)和desD (Saro_2865或SARO_RS14530)处有缺失，使其能够在细胞外积累PDC，这是酚类代谢的一个中间体。除非另有说明，否则使用反渗透（RO）水。

本研究中使用的其他化学品包括氢氧化铵溶液（28.0-30.0% NH₃ basis, Sigma-Aldrich）、硫酸铜（CuSO₄, ≥99%, Sigma-Aldrich）、2,2'-联吡啶（bpy, ACS级, Sigma-Aldrich）、乙酸钯（Pd(OAc)₂, 98%, Aldrich）、氧化铝（Al₂O₃, type WN-6, neutral, activity grade super I, Sigma-Aldrich）、六水合氯化镍（NiCl₂·6H₂O, 99.9999%, Aldrich）、四水合乙酸镁（Mg(OAc)₂·4H₂O, 99%, Aldrich）、乙醇（无水, 200 proof, Decon Labs）、72wt%硫酸（H₂SO₄, RICCA）、乙酸乙酯（LC–MS CHROMASOLV, Fluka Analytical）、氘代二甲基亚砜（DMSO-d₆, 99.9 atom% D, Sigma-Aldrich）、二甲基亚砜（DMSO, certified ACS, Fisher Chemical）、甲酸（LC/MS, Fisher Scientific）、乙腈（ACN, CHROMASOLV LC–MS, Honeywell）、甲醇（MeOH, CHROMASOLV LC–MS, Honeywell）、氢氧化钠（NaOH, ≥97.0%, Sigma-Aldrich）、4-羟基苯甲酰胺（pHBAm, 98%, Aldrich）、4-羟基苯甲酸（pHBA, 99%, Aldrich）和苯酚（≥99%, Sigma-Aldrich）。

氨预处理

对于杨木的氨预处理，向一个300 mL聚四氟乙烯内衬中加入20或30克干杨木片、金属添加剂、氨水（NH₄OH, 28.0–30.0 wt%）和RO水，以达到液固比4:1，液体中最终氨浓度18 wt%，以及设计的金属剂量（基于生物质）。为了研究金属对氨预处理的影响，添加了五种不同的金属添加剂。Cu(bpy)由CuSO₄和bpy制备，并按文献方法以最终Cu/bpy摩尔比1:1使用。其他金属添加剂按原样添加。将聚四氟乙烯内衬盖紧并装入500 mL不锈钢反应釜中，密封后装入滚动烘箱。滚动混合，烘箱温度目标为145°C，总时间为3.5小时，其中包括约50分钟的升温时间和约160分钟在145°C的保持时间。3.5小时结束后，加热器自动关闭，烘箱门关闭，滚轴继续运行，过夜冷却。

冷却至室温后，将浆液转移至带有2500目（5 μm）膜的不锈钢细胞中。从细胞顶部施加加压空气以驱动固液分离。收集废液供后续使用。

进行了相同的操作以评估pHBA和pHBAm在氨预处理环境中的转化。生成的液体样品用4 N H₂SO₄水溶液中和并过滤，用于液相色谱-质谱（LC-MS）分析。

液液萃取、LC-MS和LC分级分离

废液（pH ≈11.5）首先用两倍体积的乙酸乙酯萃取，以去除在高碱性条件下可萃取的有机化合物。收集乙酸乙酯层后，剩余的废液用72wt%硫酸（H₂SO₄）酸化至pH 1-1.5，并用两倍体积的新鲜乙酸乙酯进行第二次萃取，以去除在酸性条件下更易萃取的有机化合物（例如pHBA）。酸性和碱性乙酸乙酯萃取物合并，在Heidolph旋转蒸发仪上干燥约45分钟，并冷冻干燥过夜，残余物称为“液体萃取物”。将“液体萃取物”溶解在DMSO-d₆中，用于核磁共振（NMR）光谱、LC-MS分析、色谱分级分离和微生物转化为PDC。根据需要，用DMSO稀释DMSO-d₆中的“液体萃取物”。

LC-MS分析在Shimadzu Prominence HPLC系统上进行，使用Phenomenex Kinetex PFP分析柱（5 μm, 100 ?, 250 × 4.60 mm）、LCMS-8040质谱仪和PEAK Scientific Genius氮气发生器。收集每个运行的色谱图、PDA吸收（250-500 nm）和质谱。流动相为0.1 v%甲酸的Mili-Q水（A相）和0.1 v%甲酸的3:1 v/v乙腈:甲醇（B相）。使用15分钟线性梯度程序控制流动相组成：B相在0-0.5分钟为1%，1分钟时为14%，5分钟时为16%，8分钟时为80%，10.5-11.5分钟时为95%，并在13-15分钟时回到1%以重置色谱柱。进样体积为1-30 μL，根据需要调整，当检测器未饱和时，同一峰的PDA面积与进样体积成正比。将pHBAm、pHBA和苯酚标准品溶解在甲醇中进行LC-MS分析，同时使用PDA吸收峰面积和相应浓度（mM）建立标准曲线，得到以下公式：

A_pHBAm = 1.77×10⁸ × C_pHBAm (R² = 0.9996)

A_pHBA = 1.88×10⁸ × C_pHBA (R² = 0.9998)

A_Phenol = 1.28×10⁸ × C_Phenol (R² = 0.9999)

其中C表示浓度（mM），A表示pHBAm或pHBA在250 nm处以及苯酚在270 nm处的PDA吸收面积。

使用Shimadzu Prominence HPLC系统，配备Phenomenex Kinetex F5半制备柱（5 μm, 100 ?, 250 × 10 mm）和Shimadzu SPD-M20A制备流通池，对DMSO中的“液体萃取物”进行LC分级分离。流动相与LC-MS相同。使用45分钟线性梯度程序控制流动相组成：B相在0-5分钟为1%，20分钟时为16%，34-37分钟时为95%，并在40-45分钟时回到1%以重置色谱柱。每次运行的进样体积为50或100 μL，以平衡最佳分离度和最大进样量。半制备柱分离的馏分在流通池后收集，干燥并重新溶解在DMSO-d₆中，用于NMR和LC-MS分析。

NMR光谱

使用DMSO-d₆作为溶剂，在NEO 700 MHz光谱仪（Bruker Corp., Billerica, MA, USA）上获取“液体萃取物”样品和参考标准品（pHBAm、pHBA、苯酚、bpy）的NMR光谱，该光谱仪配备低温冷却的5 mm QCI ¹H/³¹P/¹³C/¹⁵N反向几何低温探头（质子线圈更靠近样品）。¹H–¹³C相关实验是绝热HSQC实验（Bruker标准脉冲序列“hsqcetgpsisp2.2”；使用绝热脉冲进行反转和重聚焦的相敏梯度编辑2D异核单量子相干（HSQC）），使用以下参数进行：在F2 (¹H)中从11.65到-0.66 ppm采集，具有3,448个数据点（采集时间，200 ms），在F1 (¹³C)中从215到-5 ppm采集，具有618个增量（F1采集时间，8 ms），8次扫描，扫描间隔延迟1秒；d₂₄延迟设置为0.89 ms (1/8 J, J = 140 Hz)。使用Bruker TopSpin 4.4.0软件（Mac版本）处理数据，在F2中使用典型匹配高斯变迹（LB = -0.1, GB = 0.001），在F1中使用平方余弦钟形（不使用线性预测）。中心溶剂峰（DMSO-d₆ δ_H 2.49 δ_C 39.50 ppm）用作参考。HSQC光谱中pHBAm、pHBA和苯酚的面积积分用于确定它们的摩尔比，总结在表中。

杨木及预处理后固体中的pHB-酯

杨木和氨预处理后固体中的酯连接p-羟基苯甲酸酯（pHB-酯）的测定遵循文献方法。简而言之，将木粉（5 mg）或预处理后的固体（15 mg）在2 mL小瓶中用1 mL 2 M NaOH水溶液在90°C沙浴中处理90分钟。通过将小瓶浸入冰水中终止反应。在19,000 rpm离心3分钟后，上清液过滤（0.45 μm尼龙过滤器），并通过LC-MS分析以确定pHBA的摩尔量，该值用作杨木或预处理后固体中pHB-酯的摩尔量（N_pHB-酯）。根据以下公式计算反应液中pHB-酯的理论浓度（C_pHB-酯，单位为mM）：

C_pHB-酯 = N_pHB-酯 / V_液体

其中N_pHB-酯是杨木片或处理后固体中pHB-酯的量（mmol），V_液体是氨预处理总液的体积（升）。

然后根据以下公式计算pHB-酯的回收率：

回收率 (%) = 100 × (C_pHBAm + C_pHBA + C_Phenol) / (C_pHB-酯t0 - C_pHB-酯t1)

其中C_pHBAm + C_pHBA + C_Phenol（单位为mM）是氨预处理后废液中检测到的三种酚类的总浓度，C_pHB-酯t0和C_pHB-酯t1是根据公式确定的氨预处理开始和结束时pHB-酯的理论浓度。

类似地，根据以下公式计算pHBA或pHBAm的回收率：

回收率 (%) = 100 × (C_产物) / C_{底物_t0}

其中C_{底物_t0}是氨处理开始时pHBA或pHBAm的理论浓度。

从提取的酚类化合物生产PDC

PDC的生产按照先前的研究进行。在每个无菌锥形瓶中加入200 μL含芳香族化合物的样品、8.8 mL SMB培养基和1 mL芳香烃杆菌PDC菌株培养物，在无菌条件下操作。混合后，立即取0.6 mL等分试样并过滤，用于测量初始浓度（t₀）。在30°C和200 rpm的摇床（Innova 2300）中进行培养。24小时后，收集另一个0.6 mL等分试样并过滤，用于测量24小时浓度（t₂₄）。收集的样品在分析前储存在冷冻器中。在接种时和24小时培养后，使用Klett-Summerson光电比色计评估细胞密度。

通过LC-MS测定培养开始和结束时的酚类和PDC。将PDC标准品溶解在DMSO中进行LC-MS分析，使用其在313 nm处的PDA吸收峰面积建立标准曲线，得到以下公式：

A_PDC = 1.03×10⁸ × C_PDC (R² = 0.9998)

其中C_PDC是PDC浓度（mM），A_PDC是PDC在313 nm处的PDA吸收峰面积。

基于消耗的[pHBAm+pHBA]的PDC摩尔产率（Y_PDC）根据以下公式计算：

Y_PDC (%) = 100 × C_{PDC_t24} / ( (C_{pHBAm_t0} + C_{pHBA_t0}) - (C_{pHBAm_t24} + C_{pHBA_t24}) )

基于初始[pHBAm+pHBA]的PDC摩尔产率（Y_PDC）根据以下公式计算：

Y_PDC (%) = 100 × C_{PDC_t24} / (C_{pHBAm_t0} + C_{pHBA_t0})

其中C_{PDC_t24}、C_{pHBAm_t24}和C_{pHBA_t24}是培养24小时时PDC、pHBAm和pHBA的浓度（mM），C_{pHBAm_t0}和C_{pHBA_t0}是培养开始时pHBAm和pHBA的浓度（mM）。

结果与讨论

液体萃取物的表征

通过NMR进行组成概述

“液体萃取物”样品是通过溶剂萃取氨预处理后的废液产生的。所有“液体萃取物”样品的HSQC NMR谱图相似：乙酰胺（CH₃CONH₂, δ_H 1.79 δ_C 22.5 ppm）的一个主峰和周围的几个小峰；以及芳香区域的强信号。对芳香区域的峰进行了详细指认，并显示了两个代表性谱图。主要峰根据标准品的光谱指认，即p-羟基苯甲酰胺（pHBAm_2/6 δ_H 7.72 δ_C 129.3 ppm, pHBAm_3/5 δ_H 6.77 δ_C 114.5 ppm）、p-羟基苯甲酸（pHBA_2/6 δ_H 7.78 δ_C 131.3 ppm, pHBA_3/5 δ_H 6.81 δ_C 114.9 ppm）、苯酚（Phenol₁ δ_H 6.75 δ_C 118.6 ppm, Phenol_2/6 δ_H 7.14 δ_C 129.2 ppm, Phenol_3/5 δ_H 6.73 δ_C 115.0 ppm）和2,2'-联吡啶（bpy_3/3' δ_H 8.68 δ_C 149.1 ppm, bpy_4/4' δ_H 7.44 δ_C 124.0 ppm, bpy_5/5' δ_H 7.93 δ_C 137.1 ppm, bpy_6/6' δ_H 8.38 δ_C 120.2 ppm）。紫丁香基结构（S_2/6 δ_H 6.57 δ_C 103.6, S'_2/6 δ_H 7.19 δ_C 106.3, LBHK-S_2/6 δ_H 6.55 δ_C 105.7）根据文献指认。在HSQC NMR的芳香区域也存在未识别的信号（黑线）。

基于LC和NMR的酚类化合物

为了进一步鉴定主要酚类物质，对“液体萃取物”样品进行了LC-MS分析。显示了标准品（pHBAm、pHBA和苯酚）和所有“液体萃取物”样品的LC色谱图（λ = 254 nm）。总结如图，“液体萃取物”样品包含一个在5.08分钟洗脱的大峰，其与pHBAm标准品的保留时间、质荷比（m/z = 137）和紫外吸收 profile（λ_max = 250 nm）相匹配。7.15分钟的峰与pHBA标准品的性质相匹配（m/z = 138, λ_max = 256 nm），9.11分钟的峰与苯酚标准品的性质相匹配（m/z = 94, λ_max = 270 nm）。对于含有Cu(bpy)的样品，2,2'-联吡啶（bpy）在6.3分钟作为一个宽峰洗脱。在9.3-10.5分钟附近也有弱峰。

在Kinetex F5半制备柱上对“液体萃取物”进行分级分离，以验证这些组分的身份。收集每个馏分，干燥并重新溶解在DMSO-d₆中，用于LC-MS和NMR分析。显示了收集的pHBAm、pHBA和苯酚馏分的NMR ¹H（框上方）和¹H–¹³C HSQC（框内）谱图，这些谱图与其标准品的谱图完全匹配。

使用外部校准曲线测定“液体萃取物”样品中pHBAm、pHBA和苯酚的浓度，它们在原始废液中的相应浓度总结在表中（#1-6）。与对照（#1, 6.07 mM）相比，在存在Cu(byp) (#2)、Pd(OAc)₂ (#3)、Al₂O₃ (#4)、NiCl₂ (#5)和Mg(OAc)₂ (#6)的情况下，氨预处理结束时pHBAm浓度（mM）分别降低了37%、17%、3%、20%和10%。pHBA浓度与#1 (1.36 mM)相比，#2-6分别降低了64%、48%、41%、57%和38%。苯酚浓度与#1 (13.0 mM)相比，#2-6分别降低了18%、20%、14%、8%和8%。

为了确定pHBA是否产生pHBAm和苯酚，以及金属添加剂是否促进pHBAm、pHBA和苯酚的合成和/或降解，研究了仅pHBA或pHBAm对照以及添加金属添加剂的氨预处理，其结果总结在表中（#7-20）。结果表明，pHBA几乎定量地转化为苯酚（产率92%-104%），但pHBAm并非由pHBA产生，表明在本研究使用的温度（≤145°C）下，pHBA发生了脱羧反应而非胺化反应。较长反应时间（#8）下pHBA底物的总回收率低于较短反应时间（#7），表明可能存在降解，而pHBAm在较长反应时间内是稳定的。在较长反应时间下，pHBA更完全地转化为苯酚（#7 vs #8-13）。在pHBA氨预处理的相同反应时间下（#8-13），金属添加剂没有