木霉菌种间原生质体融合增强对埃及棉铃虫的杀虫活性：多基因鉴定与遗传改良研究

为解决埃及棉铃虫(Spodoptera littoralis)抗药性严重且化学农药环境风险高的问题，研究人员通过多基因位点(tef1-α/rpb2)鉴定埃及本土木霉(Trichoderma spp.)，并采用种间原生质体融合技术创制高毒力融合菌株。研究发现融合子Fus8几丁质酶活性提升超110%，杀虫率达74%，温室防效接近化学农药。该研究为农业害虫绿色防控提供了新策略。

　　

在地中海和非洲地区，一种名为埃及棉铃虫(Spodoptera littoralis)的农业害虫正肆虐着超过80种经济作物，包括棉花、玉米和番茄等。这种害虫不仅食性广泛、繁殖力强，更令人头疼的是它对多种化学杀虫剂产生了抗药性。尽管化学农药能在短期内压制虫害，但长期使用会带来环境污染、生态平衡破坏以及健康风险等问题。面对这一困境，科学家们将目光投向了生物防治——利用自然界的天敌来控制害虫。其中，木霉菌(Trichoderma spp.)因其既能抑制植物病原菌，又显示出杀虫潜力而备受关注。这类真菌能产生几丁质酶(chitinase)、肽醛(peptaibols)和胶霉毒素(gliotoxin)等物质，破坏昆虫体壁，还能诱导植物产生系统抗性(ISR)。然而，埃及本土木霉菌的资源尚未充分开发，且田间防效不稳定。为此，来自埃及Menoufia大学的研究团队开展了一项创新研究，通过遗传改良手段提升木霉菌的杀虫效能，相关成果发表在《Microbial Cell Factories》上。

为开展本研究，团队首先从本土分离的31株木霉菌中筛选出高活性菌株，通过多基因位点（翻译延伸因子tef1-α和RNA聚合酶II大亚基rpb2）进行分子鉴定。采用最大似然法构建系统发育树分析遗传多样性。通过定性（溴甲酚紫显色法）和定量（DNS法测N-乙酰-β-D-葡萄糖胺NAGA释放量）实验评估几丁质酶活性。使用口服和体表接种法进行杀虫生物测定。关键创新在于采用种间原生质体融合技术：以特比萘芬(terbinafine)和制霉菌素(nystatin)为抗性标记，通过聚乙二醇(PEG 6000)融合Trichoderma asperellum Tricho5和T. harzianum Tricho30的原生质体，获得20个稳定融合子。最后通过温室试验（供试植物为甘蓝）验证融合子对棉铃虫的致死率和拒食效应。

分子鉴定与系统发育分析：

通过PCR扩增tef1-α和rpb2基因并测序，31株木霉菌被鉴定为三个种：T. harzianum（23株）、T. asperellum（6株）和T. longibrachiatum（2株）。系统发育树显示这三个种形成三个独立的高支持率分支（ bootstrap值>80%），表明多基因位点能有效区分近缘种。基因序列已提交GenBank（登录号如PP556982-PP566733）。

几丁质酶活性测定：

定性检测中，菌株Tricho5、Tricho11、Tricho16等显示紫色水解圈直径最大（高活性），而Tricho1、Tricho2等无活性。定量分析表明，Tricho5（T. asperellum）、Tricho30（T. harzianum）和Tricho19（T. longibrachiatum）的酶活性最高（单位IU/mL），分别达4.651、4.567和相近水平。几丁质酶活性与后续杀虫效果呈正相关。

杀虫生物测定：

口服孢子悬浮液处理第三龄棉铃虫幼虫的效果优于体表接种。Tricho30孢子在6天内导致85%以上死亡率，Tricho5和Tricho19也表现良好。培养滤液处理表明次生代谢物贡献毒性。对照组死亡率<10%。

原生质体融合与融合子评价：

以Terbinafine（150 μg/mL）和Nystatin（200 μg/mL）为选择标记，亲本Tricho5和Tricho30的原生质体存活率分别为79.8%和82.5%。PEG融合后获得20个稳定融合子（Fus1-Fus20）。融合子Fus3、Fus7和Fus8的几丁质酶活性提升最显著：Fus3定量活性达5.139 IU/mL（比亲本提高110.52%），Fus8为5.099 IU/mL（提高109.7%）。定性检测中Fus7水解圈直径9 cm（提高176.47%）。

融合子杀虫效果：

实验室口服试验中，Fus8第5天死亡率达100%，接近化学农药（Lambda-Cyhalothrin 5%）的速效性。Fus3和Fus7分别为61%和64%。温室试验中，Fus8的10天平均死亡率62%（亲本Tricho5和Tricho30仅31-33%），拒食指数(AFI)达39%。Fus8处理甘蓝植株长势更好，叶片损伤轻。

本研究通过多基因鉴定明确了埃及本土木霉菌的种质资源，并成功利用原生质体融合技术创制出高杀虫活性的融合菌株。融合子Fus8的几丁质酶产量和杀虫率显著提升，其温室防效接近化学农药，且兼具拒食和促生作用。该研究不仅为木霉菌的遗传改良提供了有效策略（无需依赖转基因技术），也为解决埃及棉铃虫抗药性问题提供了可持续的绿色防控方案。未来需进一步评估融合菌株的田间稳定性、广谱性和商业化潜力，以推动其在实际农业中的应用。