[2Fe-2S]簇结合驱动大肠杆菌铁摄取调节蛋白（Fur）二聚化的机制研究及其在铁锌竞争调控中的意义

本研究针对铁摄取调节蛋白（Fur）在感应铁信号并调控基因表达中的具体机制展开深入探讨。研究人员发现，Fur通过结合[2Fe-2S]簇或Zn(II)形成二聚体，从而激活其DNA结合活性。该研究揭示了铁和锌在Fur结合位点上的竞争关系，阐明了Fur在维持胞内铁稳态中的关键作用，对理解细菌中铁信号传导及金属离子干扰机制具有重要意义。

　　

铁是几乎所有生物体必需的微量元素，尤其在细菌中，铁稳态的维持对生存和致病性至关重要。铁摄取调节蛋白（Ferric Uptake Regulator, Fur）作为一类全局性转录因子，长期以来被认为通过结合Fe(II)来感应细胞内铁浓度，进而调控下游基因表达。然而，尽管体外实验显示Fur可结合多种二价金属离子，真正的“Fe(II)-Fur”复合体在体内一直未被明确鉴定，其感应机制及结构基础存在较大争议。

近年来，多项研究提示Fur可能通过结合铁硫簇而非单核铁来响应铁信号。例如，在铁充足条件下，大肠杆菌Fur蛋白呈现红色，初步光谱分析提示其可能含[2Fe-2S]簇。然而，这一现象背后的结构机制、调控逻辑以及其它金属离子（如锌）是否干扰这一过程，仍不清楚。

为此，来自路易斯安那州立大学的Fatemeh Najafi、Aidan G. Purcell、Finbar H. Homes和Huangen Ding研究团队在《Journal of Biological Chemistry》发表了他们的最新研究成果。他们系统探讨了Fur在感应不同金属信号时的构象变化、二聚化状态以及DNA结合活性，明确了[2Fe-2S]簇与Zn(II)在结合位点上的竞争关系，为理解Fur蛋白在金属稳态调控中的核心作用提供了关键证据。

本研究主要采用了蛋白质纯化、紫外-可见吸收光谱、凝胶过滤层析、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、位点定向突变以及限制性内切酶保护实验等技术方法。实验使用大肠杆菌Fur缺失突变株及IscU缺失突变株作为蛋白表达系统，在M9基本培养基中分别添加铁或锌，以获取不同金属状态的Fur蛋白。

研究结果主要包括以下几个方面：

一、[2Fe-2S]簇结合的大肠杆菌Fur为同源二聚体

研究人员在添加Fe(II)的M9培养基中表达并纯化Fur，发现该蛋白呈红色，紫外光谱显示其在325 nm、410 nm和450 nm有特征吸收峰，与[2Fe-2S]簇的光谱特性一致。凝胶过滤分析表明，该条件下纯化的Fur存在两个群体：约45 kDa的二聚体和23 kDa的单体。进一步分离显示，二聚体组分具有[2Fe-2S]簇特征吸收，而单体则无。圆二色谱提示二者二级结构相似，但二聚体在构象上发生了一定改变。金属含量分析表明，每个Fur单体平均结合1.86个铁原子和1.60个硫原子，且几乎无锌掺杂，说明[2Fe-2S]簇以1:1的比例与Fur单体结合。

二、[2Fe-2S]簇结合的Fur二聚体与Zn(II)结合的Fur二聚体具有类似的Fur-box结合活性

通过HinfI限制性位点保护实验，研究人员比较了不同金属状态下Fur的DNA结合能力。结果显示，无论是[2Fe-2S]簇结合的Fur二聚体还是Zn(II)结合的Fur二聚体，均在0.5 μM浓度下即可有效保护Fur-box序列免受酶切，而apo形式的Fur单体则无此活性。这表明两种金属形式的Fur在体外具有相似的基因结合能力。

三、Fur通过同一结合位点（位点3）结合Zn(II)与[2Fe-2S]簇

通过AlphaFold2预测的全长Fur结构模型，研究人员聚焦于三个保守金属结合位点：位点1（His-87、Asp-89、Glu-108、His-125）、位点2（His-33、Glu-81、His-88、His-90）和位点3（Cys-93、Cys-96）。他们构建了多位点突变体（E108A、H90A、C93A），并在加铁培养基中表达这些蛋白。结果显示，位点1和位点2的突变不影响[2Fe-2S]簇的结合与二聚化，而位点3突变体C93A则完全丧失了簇结合能力，且仅以单体形式存在。同样，在加锌条件下，C93A突变体也无法结合锌或形成二聚体。这表明位点3是Fur感应金属并发生二聚化的关键位点。

四、[2Fe-2S]簇结合的Fur二聚体在还原条件下解离为单体

当[2Fe-2S]簇结合的Fur二聚体被连二亚硫酸钠还原后，其簇迅速解离，蛋白变为无色，且二聚体完全解离为单体。这一过程可逆，体外重组[2Fe-2S]簇可恢复其二聚化及DNA结合活性。相反，Zn(II)-Fur二聚体在还原条件下仍保持稳定，说明其不具备氧化还原敏感性。

五、铁硫簇组装支架蛋白IscU为[2Fe-2S]簇介导的Fur二聚化所必需，但不影响Zn(II)介导的二聚化

在IscU缺失突变株中，即使培养基添加铁，Fur也无法组装[2Fe-2S]簇，且仅以单体形式存在。然而，在加锌条件下，IscU的缺失并不影响Fur结合锌或形成二聚体。这表明[2Fe-2S]簇的组装依赖细菌的铁硫簇组装系统，而锌的结合则可能通过非酶促方式完成。

六、Zn(II)在体内竞争[2Fe-2S]簇在Fur上的结合

为验证锌与铁在结合Fur时的竞争关系，研究人员在加铁培养基中逐步提高锌浓度。结果显示，随着锌浓度增加，Fur蛋白中[2Fe-2S]簇的信号逐渐减弱，取而代之的是锌结合形式的二聚体比例上升。这表明Zn(II)可有效竞争Fur上的金属结合位点，干扰其铁感应功能。

在讨论部分，作者提出一个全新模型：在锌等干扰金属浓度较低时，Fur通过铁硫簇组装机制在位点3组装[2Fe-2S]簇，进而形成二聚体，激活其对铁稳态基因的调控；而当锌浓度升高时，Zn(II)竞争性地占据位点3，阻碍[2Fe-2S]簇的组装，使Fur无法正常感应铁信号，从而导致铁稳态失调。

该研究不仅彻底更新了对Fur蛋白感应机制的理解，揭示了其作为铁硫蛋白的身份，还阐明了锌如何通过金属竞争破坏细菌铁稳态，为针对细菌铁代谢的抗菌策略提供了新思路。此外，该研究中建立的光谱、层析与功能分析相结合的研究方法，也为研究金属蛋白质组提供了重要范例。