锥虫穹隆体由三种主要穹隆蛋白旁系同源物构成并携带穹隆RNA，其相互作用组揭示与剪接机制的联系

本刊推荐：为解决真核生物中功能未知的穹隆体（vault）粒子功能问题，研究人员以布氏锥虫（Trypanosoma brucei）为模型，综合运用亲和捕获蛋白质组学与TurboID邻近标记技术，解析了其MVP（major vault protein）相互作用组。研究发现锥虫穹隆体由三种高度分化的MVP旁系同源物共同组装而成，且与剪接因子、RNA结合蛋白显著相关，证实了vtRNA（vault RNA）与粒子的紧密结合及其在mRNA成熟中的潜在作用，为揭示这一古老细胞器的功能提供了关键线索。

　　

在真核生物庞大的细胞世界中，存在着许多结构精美却功能成谜的细胞器，穹隆体（vault）便是其中之一。这种以其独特的穹顶状结构命名的巨大核糖核蛋白复合物，尺寸堪比三个核糖体，自发现以来其生物学功能就一直笼罩在神秘之中。尽管从哺乳动物到黏菌的多种生物中都存在它的身影，但令人费解的是，敲除其核心组分基因的动物却往往活得“云淡风轻”，几乎不表现出任何明显的生理缺陷。这种巨大的结构保守性与模糊的表型之间的强烈反差，成为了细胞生物学中一个引人入胜的未解之谜。

近年来，一种名为布氏锥虫（Trypanosoma brucei）的单细胞寄生生物为破解这一谜题带来了新的曙光。这种引发非洲昏睡病的病原体，其基因表达方式极为特殊：它所有的mRNA都需要通过反式剪接（trans-splicing）来成熟。有趣的是，近期有研究发现，锥虫中的穹隆RNA（vtRNA）对于这一至关重要的剪接过程不可或缺。这一发现立刻将穹隆体——这个vtRNA的已知“住所”——推到了锥虫核心基因表达调控舞台的中央。然而，锥虫的穹隆体究竟由什么组成？它与vtRNA如何协作？又与剪接机器有何关联？这些问题依然悬而未决。为了回答这些问题，由Anna Zavrelova、Siqi Shen等人组成的研究团队开展了一项深入的研究，其成果发表在《Journal of Biological Chemistry》上。

为了系统解析锥虫穹隆体的组成与功能，研究人员整合运用了多种前沿技术。研究以布氏锥虫 procyclic form（PCF）为模型细胞。关键技术包括：1) 基因编辑与细胞系构建：利用pMOT/pPOT系统对MVP和TEP1基因进行内源性标记，构建了表达eYFP（增强型黄色荧光蛋白）、mCherry、TurboID-2xHA（TurboID邻近标记系统）和OsAID-3xHA（auxin-inducible degron，辅助素诱导降解系统）融合蛋白的多种细胞系。2) 冷冻研磨亲和捕获蛋白质组学（Cryomilling affinity capture proteomics）：在近天然状态下破碎细胞，利用抗GFP纳米抗体 beads 免疫沉淀MVP1复合物，并通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行定量分析。3) TurboID邻近标记蛋白质组学：利用TurboID生物素连接酶在活细胞中对MVP1和TEP1的邻近蛋白质进行生物素标记，通过链霉亲和素纯化与质谱鉴定其相互作用组。4) 单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）：采用ViewRNA? ISH技术，特别是在LR-White树脂包埋的超薄切片上进行检测，以实现对高丰度vtRNA的准确定量与定位。5) 超高分辨率显微镜技术：包括扩展显微镜（UExM）用于增强信号检测，以及双色荧光共定位成像分析。

Trypanosomes encode three MVP paralogs.

研究人员首先在布氏锥虫基因组中鉴定出三个MVP旁系同源物，分别命名为MVP1 (Tb927.5.4460)、MVP2 (Tb927.10.1990) 和 MVP3 (Tb927.10.6310)。它们之间的序列相似度出人意料地低（MVP1与MVP2为58%，MVP1与MVP3为56%，MVP2与MVP3仅为52%），表明它们在进化中发生了显著的分化。

MVP1 N-terminal eYFP fusion localizes to cytoplasmic particles.

将eYFP融合在MVP1的N端后，荧光显微镜下可见其形成大小均一的颗粒状结构，定位于细胞质中，每个细胞中有超过100个这样的颗粒，这与经典穹隆粒子的特征相符。后续的亲和捕获实验以eYFP-MVP1为“诱饵”，在多种去垢剂和盐浓度条件下进行。令人惊讶的是，捕获到的蛋白质中，另外两个MVP旁系同源物（MVP2和MVP3）的丰度与“诱饵”MVP1相当，强烈暗示三者可能共同组装在同一个穹隆体粒子中。

Proximity labeling with MVP1 and TEP1.

为了验证上述发现并捕获更瞬时的相互作用，研究人员采用了TurboID邻近标记技术。他们将TurboID分别与MVP1和TEP1（telomerase associated protein 1，已知的穹隆体组分）融合。尽管由于穹隆体壳的致密性导致抗体检测困难，但通过扩展显微镜技术，成功观察到TurboID-TEP1定位于细胞质颗粒。质谱分析结果显示，MVP1和TEP1的TurboID相互作用组高度一致，均显著富集了剪接相关因子。

The vault interactome is enriched in splicing factors.

综合亲和捕获与TurboID两种正交方法的数据，研究人员得到了一个包含103个蛋白质的高置信度相互作用组。其中，除了三个MVP和TEP1这一核心成分外，最引人注目的是一大批RNA结合蛋白和剪接因子，包括富含丝氨酸-精氨酸结构域（SR-domain）的蛋白RBSR1和TSR1，以及U5-200k、U2AF35等。这些蛋白主要定位于细胞核，暗示只有一小部分会与胞质中的穹隆体发生瞬时相互作用，可能与vtRNA的运输或功能有关。

vtRNA is highly abundant and primarily in the cytoplasm

vtRNA的定位和丰度一直存在争议。先前研究利用传统FISH技术认为vtRNA exclusively位于核内。本研究创新性地采用LR-White树脂包埋切片进行smFISH，使探针能平等地接触到所有RNA。结果发现，超过90%的vtRNA信号明确位于细胞质中，其分子数量与最丰富的锥虫mRNA之一——EP1 mRNA——处于同一水平（约500个/细胞）。而在完整细胞上做smFISH时，可检测到的vtRNA信号却很少（<10个/细胞），这表明大部分vtRNA被紧密地包裹在穹隆体内部，受到了良好的保护。

vtRNA co-immunoprecipitates with MVP1

为了从生化角度证实vtRNA与穹隆粒子的结合，研究人员在RNA酶抑制剂存在下进行了eYFP-MVP1的免疫共沉淀实验。随后通过RT-PCR，成功地从沉淀物中检测到了vtRNA，直接证明了vtRNA是锥虫穹隆体的一个组成部分。

MVP1 is dispensable for T. brucei viability under culture conditions.

尽管穹隆体结构复杂且与核心的mRNA代谢过程相关，但功能缺失实验表明，在实验室培养条件下，它并非是锥虫存活所必需的。利用auxin-inducible degron系统高效降解MVP1后，锥虫的生长未受任何影响。对TEP1进行RNAi knockdown（由于其基因长度限制，敲低效率有限）同样未引发生长缺陷。这与哺乳动物中的研究结果一致，表明穹隆体的功能可能更体现在应对特定环境压力上，而非基础生长。

The vault shell is composed of all three MVP isoforms.

最关键的证据来自双色荧光共定位实验。研究人员构建了同时表达eYFP-MVP和mCherry-MVP不同组合的细胞系。荧光显微镜观察显示，任意两种MVP融合蛋白发出的信号都完美地共定位于相同的细胞质颗粒上。这强有力地证明，每一个穹隆体壳都是由MVP1、MVP2和MVP3三种蛋白共同组装而成的异源多聚体。AlphaFold3的蛋白质结构预测模型也支持这三种蛋白可以形成稳定的异源三聚体。

Phylogenetic analysis of MVP paralogs

系统发育分析表明，编码三个MVP旁系同源物是动基体目（Kinetoplastida）寄生虫（包括锥虫、利什曼原虫等）的一个保守特征。而在更广泛的Discoba类群（包括眼虫、双鞭毛虫等）中，MVP的存在很普遍，但出现三副本的情况则几乎是动基体目所独有的。TEP1的存在与MVP呈正相关，但在一些类群中可能发生了C端结构的显著分化或丢失。

本研究得出结论：布氏锥虫的穹隆体是一个由三种高度分化的主要穹隆蛋白（MVP）旁系同源物共同组装而成的异源多聚体复合物。其核心成分包括MVP1、MVP2、MVP3和TEP1，并包裹着vtRNA。更重要的是，其相互作用组与剪接机器存在显著关联，为vtRNA调控mRNA反式剪接的功能提供了直接的结构基础。研究还纠正了先前关于vtRNA exclusively核定位的观点，证实其主体存在于胞质并与穹隆粒子紧密结合。

该研究的意义在于：首先，它揭示了穹隆体组成在不同生物间的多样性（如锥虫的三MVP系统），为理解这一古老细胞器的进化提供了新视角。其次，它通过强大的相互作用组学数据，将穹隆体与mRNA代谢的关键过程——剪接直接联系起来，为破解穹隆体功能这一长期悬案提供了迄今为止最有力的线索。最后，鉴于锥虫特殊的剪接机制是其致命的弱点，该研究也为开发针对这些寄生虫的新型治疗策略提供了潜在的新靶点。