天然突变对氧脂素代谢脱氢还原酶9功能的影响：聚焦卤视紫红质Cl-转运通道中关键疏水残基的作用机制

本研究针对光驱动Cl-泵蛋白卤视紫红质（HR）在胞质侧疏水环境中高效转运Cl-的机制难题，通过系统突变分析发现Phe211和Leu214等疏水残基对维持Cl-转运通道构象变化至关重要。研究表明这些残基的突变会通过影响Lys215侧链定位导致Cl-结合位点异常，形成长寿命中间体X，显著延缓离子转运。该发现揭示了微生物视紫红质离子泵中疏水残介导的特异性构象调控机制，为理解膜蛋白离子转运的分子基础提供了新视角。

　　

在微生物的世界中，光能驱动着无数生命活动，而光驱动离子泵蛋白正是这一过程中的关键角色。其中，卤视紫红质（Halorhodopsin, HR）作为一类特殊的Cl^-泵蛋白，能够利用光能将氯离子主动转运到细胞内，维持细胞的离子平衡和能量转换。尽管这类蛋白的胞外（EC）通道富含亲水残基和水分子，但其胞质（CP）侧却主要由疏水残基构成，这种疏水性在暗态下能有效防止离子泄漏，但在光激活后却需要快速形成临时水合通道以实现离子转运。这种"特殊机制"在H⁺泵中已有较深入研究，涉及可解离的Asp、Glu或Lys等残基的质子传递，但在Cl^-泵中却一直是个谜团。

为了解开这一谜题，研究人员以来自嗜盐古菌Natronomonas pharaonis的卤视紫红质（NpHR）为模型，聚焦于其CP侧疏水通道中可能参与Cl^-转运的关键残基。通过系统的点突变和功能分析，他们发现两个位于通道出口附近的疏水残基Phe211和Leu214在维持快速Cl^-转运中扮演着不可或缺的角色。这些残基的突变不仅显著延缓了光循环过程，还导致了一种新型长寿命中间体X的形成，严重影响了Cl^-的释放效率。进一步的研究揭示，这种效应可能与邻近的带正电残基Lys215的构象变化密切相关。

本研究主要采用了分子生物学技术（包括点突变质粒构建和蛋白表达）、光谱学分析（紫外-可见吸收光谱和激光闪光光解技术）、电化学检测（基于ITO电极的Cl^-泵活性测量）以及全局拟合分析等方法。所有实验均使用大肠杆菌表达系统制备样品，并通过镍柱纯化获得重组蛋白。

Probing the important residues surrounding the hydrated channel

研究人员首先通过结构分析确定了NpHR的N中间态中围绕水合通道的10个残基，其中除Thr218和Trp222外均为疏水残基。通过将这些残基逐一替换为丙氨酸，并检测其光循环动力学变化，发现L138A、F211A和L214A三个突变体表现出显著的光循环畸变，其中F211A和L214A的影响最为突出。这些突变体在100 mM Cl^-条件下O中间体的积累大幅减少，且动力学显著延缓。

Further effects of Phe211 and Leu214 substitutions

为了进一步验证这些残基的重要性，研究人员构建了多种突变体（F211L、F211S、L214V、L214C、L214S等）。结果显示，突变为越小、越亲水的残基，对光循环的破坏越严重，其中L214S突变体的光循环需要数秒才能完成，这是NpHR突变体中从未报道过的极慢动力学。这些效应在Br^-和NO₃^-转运过程中同样存在，说明这些残基对阴离子转运具有普适重要性。

Reduced Cl^- pumping activities of the Phe211 and Leu214 mutants

通过电化学方法检测这些突变体的Cl^-泵活性，发现所有突变体的转运活性都显著降低至野生型的30-65%。这一结果与光循环动力学数据一致，证实了这些疏水残基对维持正常泵功能的重要性。

Detailed analysis of the distorted photocycles

通过全局拟合分析，研究人员发现突变体中形成了新型中间体X，其吸收光谱在540-550 nm范围内，明显不同于已知的L2、N或O中间体。这些中间体的寿命显著延长：F211A延长24倍，F211S延长20倍，L214C延长61倍，而L214S更是延长了307倍。这表明Cl^-在蛋白内部被捕获，无法顺利转运到胞质侧。

Unfavorable participation of Lys215 in Cl^- transfer

最有趣的发现是，当在F211或L214突变的基础上进一步引入K215L突变时，光循环动力学得到显著改善。这一结果说明，在单突变体中，Lys215的侧链可能发生了不利的构象变化，形成了一个不利于Cl^-转运的结合位点。单独的K215L突变也导致光循环变慢，说明Lys215在野生型蛋白中确实参与促进Cl^-转运。

在讨论部分，研究人员提出了一个模型来解释这些发现：在野生型NpHR中，Phe211和Leu214通过空间位阻作用维持Lys215处于合适的位置，使其能够临时结合Cl^-并促进其沿CP通道迁移。然而当这些疏水残基被突变后，Lys215侧链可能移位到转运路径中，形成一个强Cl^-结合位点。如果这个位点事先从周围溶液中结合了Cl^-，那么从蛋白内部迁移来的Cl^-就无法到达出口，从而导致转运受阻和X中间体的形成。

研究还比较了不同来源的Cl^-泵蛋白的序列保守性，发现古菌和蓝细菌的Cl^-泵在这些关键残基上具有较高的保守性，而海洋真细菌的Cl^-泵则可能采用不同的机制。这表明虽然疏水残基介导的构象调控可能是一个普遍原理，但具体的分子机制在不同类型的Cl^-泵中可能有所差异。

这项研究的意义在于首次揭示了NpHR中疏水残基在Cl^-转运中的关键作用，证明了这些不直接与Cl^-相互作用的残基通过调控蛋白构象变化来促进离子转运。这一发现不仅深化了对微生物视紫红质离子泵工作机制的理解，也为设计新型光驱动离子转运工具提供了重要参考。研究人员建议未来通过振动光谱等技术直接探测突变体中Cl^-结合位点的变化，并利用分子动力学模拟研究这些残基在光循环过程中的构象动力学，以进一步完善这一模型。

该研究发表于《Journal of Biological Chemistry》，通过严谨的实验设计和深入的数据分析，为理解膜蛋白离子转运的分子机制提供了重要见解，展示了疏水环境中的特异性构象调控在生物功能实现中的关键作用。