NR4A1是HIF依赖性SLC30A10转录抑制因子，调控锰稳态平衡

本研究聚焦于锰稳态调控机制，揭示了NR4A1作为HIF2依赖性转录抑制因子，通过负向调控锰外排转运蛋白SLC30A10表达，与HIF直接激活通路形成双向平衡机制。该发现完善了金属稳态调控理论，为锰毒性相关运动障碍疾病提供了新的治疗靶点。

　　

在生命活动过程中，维持必需金属元素的稳态平衡对机体健康至关重要。锰(Mn)作为多种酶的辅因子，参与骨骼发育、代谢调节和抗氧化防御等重要生理过程。然而，过量的锰暴露会导致神经毒性，引发类似帕金森病的运动障碍，这在职业暴露人群（如电焊工、矿工）和遗传性锰代谢障碍患者中尤为显著。尽管科学家早已阐明铁(Fe)、铜(Cu)、锌(Zn)等金属的稳态调控机制，但对锰稳态的理解直到近年才取得突破性进展。

先前研究发现，哺乳动物细胞通过一种缺氧诱导因子(HIF)介导的转录级联反应来应对锰过量： elevated Mn通过竞争性抑制脯氨酰羟化酶域(PHD)酶（特别是PHD2）的铁催化中心，稳定HIFα亚基（包括HIF1α和HIF2α），进而直接转录上调锰外排转运蛋白SLC30A10的表达，最终降低细胞和机体锰水平。SLC30A10是特异性锰外排转运蛋白，在肝脏、肠道和大脑中发挥关键作用。人类SLC30A10功能缺失突变会导致遗传性锰中毒，出现严重神经症状。

然而，HIF作为广谱转录因子，调控众多下游基因表达。最近的转录组学分析表明，锰暴露会引起大脑和肝脏中多种基因表达网络的改变，其中HIF1是主要驱动者。这提示除了直接上调SLC30A10外，可能还存在其他调控机制影响锰稳态。基于此，本研究深入探索了锰诱导的HIF依赖性反应中是否存在额外组分，特别是可能负向调控SLC30A10表达的机制。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下关键技术：利用慢病毒shRNA系统进行基因稳定敲减（包括NR4A1、HIF1α/HIF2α等靶点）；通过定量实时PCR(qRT-PCR)分析基因表达；采用细胞活力检测(MTT法)评估锰毒性；使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)进行金属含量分析；构建NR4A1过表达载体及其缺失突变体；利用组织特异性基因敲除小鼠模型（肝脏特异性HIF1α或HIF2α敲除鼠）进行体内验证。

Identification of NR4A1 as a Mn responsive potential repressor of SLC30A10 expression

通过筛选前期转录组学鉴定的转录因子，研究发现NR4A1（又称Nur77）敲减显著增强SLC30A10表达，提示其可能是SLC30A10的抑制因子。时间进程实验显示，锰处理可强烈上调NR4A1表达，且其动力学特征与SLC30A10不同：SLC30A10表达在4小时达到峰值后8小时恢复基线，而NR4A1表达在24小时后仍维持高水平。剂量反应实验表明NR4A1上调的细胞外锰EC₅₀约为20μM，与HIFα蛋白稳定和SLC30A10上调的敏感性范围一致。该现象在分化的SH-SY5Y神经元模型细胞和HMC3小胶质细胞模型中得到验证，表明NR4A1的锰响应性在不同细胞类型中具有普遍性。

Knockdown of NR4A1 increases SLC30A10 expression and protects against Mn-induced toxicity in a SLC30A10-dependent manner

NR4A1敲减细胞在锰处理各时间点均显示SLC30A10表达增强，但不改变其应答动力学。金属测量发现NR4A1敲减细胞内锰水平显著降低，铁水平无变化。细胞活力实验表明NR4A1敲减可保护细胞免受锰毒性损伤。为证实这种保护作用依赖于SLC30A10，研究者在SLC30A10敲除(ΔSLC30A10)细胞中重复实验，发现NR4A1敲减不再提供保护作用，明确NR4A1的调控效应依赖于SLC30A10的存在。

Overexpression of full-length NR4A1 reduces SLC30A10 expression and heightens sensitivity to Mn toxicity

过表达全长NR4A1（NR4A1_1-598）降低基础和高锰条件下SLC30A10表达，并增强细胞对锰毒性的敏感性。缺失突变实验显示，缺乏DNA结合域和配体结合域的NR4A1_1-211或缺失大部分转录激活域的NR4A1_Δ2-251均不影响SLC30A10表达，表明NR4A1的转录活性是其发挥功能所必需的。这些结果与敲减实验一致，进一步证实NR4A1通过抑制SLC30A10表达参与锰稳态调控。

The Mn-induced upregulation of NR4A1 expression is mediated by Hif2α, but not Hif1α

机制研究表明，HIF1α和HIF2α双敲减可阻断锰诱导的NR4A1上调。利用肝脏特异性HIF1α或HIF2α敲除小鼠模型发现，锰暴露可在对照组和HIF1α敲除鼠肝脏中上调NR4A1表达，但在HIF2α敲除鼠中无此效应。过表达VHL不敏感型HIF2α突变体（而非HIF1α突变体）可增强锰诱导的NR4A1表达。用PHD2抑制剂roxadustat处理可稳定HIFα蛋白并增强基础NR4A1表达。这些结果共同表明锰诱导的NR4A1上调依赖于HIF2α而非HIF1α。

研究结论表明，锰稳态的分子调控设计精巧：单一上游事件（锰抑制PHD2并激活HIF1/HIF2）既直接上调保护性通路（HIF1/HIF2直接转录激活SLC30A10），又同时激活抑制性臂膀（HIF2介导的NR4A1诱导，抑制SLC30A10表达）。这种双向调控可能防止SLC30A10过度或 prolonged upregulation导致的锰缺乏症。

讨论部分指出，NR4A1可能通过间接机制抑制SLC30A10表达，因其启动子区域未发现共识NR4A1结合序列。HIF信号与NR4A1之间存在双向关系：HIF通过NR4A1启动子上的缺氧反应元件上调其转录，而NR4A1蛋白可通过非基因组机制稳定HIFα亚基并增强HIF信号。本研究首次发现HIF2特异性介导锰诱导的NR4A1上调，这与既往缺氧研究中报告的HIF1主导机制不同，提示信号特异性可能决定HIFα亚型选择。

该研究不仅深化了对锰稳态调控机制的理解，还具有重要生物医学意义。锰诱导的运动障碍影响大量职业暴露人群和遗传易感个体，阐明NR4A1-SLC30A10调控轴为开发新型治疗策略提供了潜在靶点。研究结果发表于《Journal of Biological Chemistry》，为金属生物学和神经毒理学领域作出了重要贡献。