整合毒理学筛选与蛋白质组学分析的纳米纤维统一测试策略研究

为解决纳米纤维（NFs）因形态类似石棉而引发的潜在健康风险，研究人员开展了一项整合体外毒理学筛选与蛋白质组学分析的研究。他们比较了不同形态碳纳米材料（如Mitsui-7-JRCNM40011a、NM-400和Printex-90）对THP-1巨噬细胞表型（M0、M1、M2）的毒性效应，发现M0表型最敏感，且刚性纳米纤维Mitsui-7-JRCNM40011a引起细胞毒性、炎症、氧化应激和溶酶体功能障碍，并导致25种溶酶体蛋白（包括5种组织蛋白酶）水平下降。该研究为开发基于3R原则和动物实验替代方法（NAM）的纳米纤维统一测试策略提供了重要依据。

　　

纳米纤维（Nanofibers, NFs）尤其是多壁碳纳米管（Multi-walled carbon nanotubes, MWCNTs）因其独特的物理化学性质，在高性能电池、医疗生物传感器等工业领域展现出巨大应用潜力。然而，其纤维状形态与石棉的相似性引发了人们对潜在健康风险的担忧——特别是吸入后可能导致的纤维化、癌症和间皮瘤等石棉样疾病。根据纤维致病性范式（Fiber Pathogenicity Paradigm, FPP），只有那些具有足够生物持久性且符合特定尺寸标准（长度>5μm、直径<3μm、长径比>3:1）的刚性纤维才可能引发石棉样病理反应。但纳米纤维的直径减小会使其灵活性增加、易于缠结，从而可能丧失纤维形态，其毒性更接近生物持久性颗粒物。目前，纳米纤维的风险评估仍主要依赖动物实验，这种方法不仅耗时，还存在伦理和科学上的局限性。此外，欧盟委员会正积极推动化学品安全评估中动物试验的替代方案。因此，开发符合3R原则（替代、减少、优化）和动物实验替代方法（New Approach Methodology, NAM）的体外测试策略显得尤为迫切。

为了应对这一挑战，研究人员在《Scientific Reports》上发表了一项研究，旨在通过整合体外毒理学筛选和蛋白质组学分析，推动纳米纤维统一测试方法的发展。他们选取了三种不同形态的碳基纳米材料：代表球形颗粒的Printex-90、代表缠结纤维的NM-400，以及代表致癌性刚性纤维的Mitsui-7-JRCNM40011a，利用分化的人单核THP-1巨噬细胞样细胞（dTHP-1）模型，系统评估了它们的毒性效应和分子机制。

研究采用的关键技术方法包括：细胞毒性检测（LDH释放和WST-1代谢活性测定）、炎症反应评估（TNF-α释放ELISA）、氧化应激检测（蛋白质羰基化测定和DCFH₂-DA活性氧检测）、溶酶体完整性测试（中性红摄取试验），以及基于串联质量标记（TMT）标记和液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（LC-ESI-MS/MS）的蛋白质组学分析。所有实验均使用THP-1细胞系（源自德国微生物和细胞培养物保藏中心），通过PMA（佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯）诱导分化为M0、M1和M2表型，并在无血清休息期的情况下直接暴露于纳米材料24小时。

研究结果首先通过评估不同dTHP-1表型（M0、M1、M2）对纳米材料的敏感性，发现M0表型在细胞毒性和炎症反应检测中表现最为敏感。LDH释放实验显示，Mitsui-7-JRCNM40011a在M0和M1表型中引起浓度依赖性的细胞膜损伤，而Printex-90和NM-400未引起显著效应。M1和M2表型因基础毒性较高（LDH释放分别达55%和40%）且对材料暴露无响应而被排除。WST-1代谢活性测定进一步证实Mitsui-7-JRCNM40011a对M0和M1表型的毒性效应。炎症因子TNF-α的释放实验表明，只有M0表型对Mitsui-7-JRCNM40011a暴露表现出轻微响应，而M1和M2表型均无显著变化，提示TNF-α可能不是区分纳米材料形态效应的可靠指标。

在确定M0表型为最适模型后，研究人员通过一系列体外和细胞实验评估了纳米材料的形态依赖性毒性。DCFH₂-DA活性氧检测显示，Printex-90和NM-400具有固有的氧化活性，而Mitsui-7-JRCNM40011a反而表现出轻微的抗氧化或清除效应。然而，蛋白质羰基化测定发现所有纳米材料均引起氧化蛋白损伤，其中Mitsui-7-JRCNM40011a的效应最为显著。中性红摄取试验表明，只有Mitsui-7-JRCNM40011a在浓度≥50μg/mL时引起溶酶体完整性破坏，而其他材料无此效应。

蛋白质组学分析进一步揭示了纳米材料作用的分子机制。在25μg/mL和50μg/mL浓度下，Mitsui-7-JRCNM40011a分别引起257和777个蛋白质的显著改变，远多于Printex-90（43和134个）和NM-400（15和65个）。KEGG通路富集分析显示，Mitsui-7-JRCNM40011a特异性影响溶酶体通路，其中25个溶酶体蛋白（包括6种组织蛋白酶中的5种）水平显著下调。这一发现与中性红试验结果一致，支持溶酶体功能障碍在刚性纳米纤维毒性中的关键作用。此外，Mitsui-7-JRCNM40011a还影响了代谢通路、内质网蛋白质加工和帕金森病等相关通路，提示其毒性涉及多种细胞稳态机制的扰乱。

研究结论部分强调，这项研究通过综合应用毒理学筛选和蛋白质组学分析，证实了dTHP-1 M0巨噬细胞表型在评估纳米纤维毒性中的适用性和敏感性。刚性纳米纤维Mitsui-7-JRCNM40011a引起细胞毒性、炎症反应、氧化应激和溶酶体功能障碍，且蛋白质组学数据进一步揭示其特异性下调溶酶体蛋白（尤其是组织蛋白酶）的分子机制。这些发现不仅加深了对纳米纤维形态依赖性毒性的理解，还为开发基于体外测试和生物标志物（如多种组织蛋白酶的定量分析）的统一测试策略提供了重要依据。该策略有望支持 adverse outcome pathways (AOPs) 的完善和纳米安全风险评估，推动符合3R原则和欧盟化学安全评估目标的动物实验替代方法的发展。