靶向TDP-43的E6抗体可缓解ALS患者脑脊液诱导的致病通路

本研究针对肌萎缩侧索硬化（ALS）患者脑脊液（CSF）诱导的TDP-43蛋白病理和神经退行性病变，开发了靶向TDP-43 RRM1结构域的单克隆抗体E6。通过脑室内（i.c.v.）或鞘内（i.t.）给药，E6抗体显著改善了小鼠的运动和认知功能，减轻了TDP-43蛋白异常定位和聚集，保护了神经元的存活和神经肌肉接头（NMJ）的完整性，并促进了小胶质细胞向保护性表型的转化。该研究为针对散发性ALS的免疫治疗策略提供了重要依据。

　　

肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）是一种毁灭性的神经退行性疾病，目前尚无治愈方法。绝大多数ALS病例（约90%）属于散发性（sALS），其具体病因和发病机制至今仍不明确。一个突出的病理特征是TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）的异常，表现为其从细胞核错误定位到细胞质，形成聚集物，并失去正常功能，这一过程被称为TDP-43蛋白病。近年来，越来越多的证据表明，ALS患者的脑脊液（Cerebrospinal Fluid, CSF）中含有毒性因子，能够将病理特征“传播”或“诱导”给健康的神经元，这可能是疾病在神经系统中进展的一种方式。然而，针对散发性ALS的有效治疗策略仍然极度缺乏。

为了解决这一难题，并探索针对TDP-43蛋白病的免疫疗法在sALS中的潜力，研究人员Amélie Poulin-Brière、Silvia Pozzi和Jean-Pierre Julien团队在《Neurotherapeutics》上发表了一项重要研究。他们此前已经开发出一种名为E6的单克隆抗体，它能特异性结合TDP-43的RNA识别模体1（RRM1）结构域。在表达家族性ALS（fALS）相关突变TDP-43^A315T的转基因小鼠模型中，E6抗体已显示出良好的保护效果。但家族性ALS仅占所有病例的约10%，其研究成果能否推广到更为常见的散发性ALS中，是一个亟待回答的关键问题。

为了模拟散发性ALS，研究人员建立了一个独特的动物模型：他们将sALS患者的脑脊液（ALS-CSF）通过脑室内（i.c.v.）持续输注的方式，导入到表达人类野生型TDP-43（hTDP-43^WT）的转基因小鼠脑中，为期14天。这种处理能快速在小鼠中诱导出类似ALS的表型，包括运动和认知缺陷、TDP-43蛋白病、神经丝（Neurofilament, Nf）结构紊乱和神经炎症。利用这一模型，他们系统地评估了通过鞘内（i.t.）或脑室内（i.c.v.）途径给予E6抗体的治疗效果。

为开展此项研究，团队运用了多种关键技术方法。研究使用了从sALS患者和作为对照的非ALS（NALS）患者中获取的脑脊液样本池，通过脑室内微型渗透泵持续输注的方式构建小鼠疾病模型。治疗性抗体E6通过鞘内重复注射或与脑脊液混合后共同脑室内输注的方式给药。研究通过一系列行为学测试（包括步态分析、新物体识别NOR和被动回避PA测试）评估小鼠的神经功能。在分子和细胞层面，采用了蛋白质免疫印迹（Western Blot）和免疫荧光技术分析TDP-43的定位、聚集状态以及其他病理蛋白（如磷酸化p65, CD68, iNOS）的变化。通过免疫荧光染色和计数评估了脊髓运动神经元的存活率和神经肌肉接头（NMJ）的支配情况。此外，还利用报告细胞系（NSC-34-luc-p65和BV2-luc-p65）在体外评估了脑脊液诱导的NF-κB炎症通路激活，并通过细胞因子抗体阵列分析了小胶质细胞分泌的炎症因子谱。

研究结果

ALS-CSF contains more TDP-43 and induces p65-NFκB activation in vitro（ALS-CSF含有更多TDP-43并在体外诱导p65-NFκB激活）

研究人员首先证实，与对照组（NALS-CSF）相比，sALS患者的脑脊液中TDP-43的总水平显著更高。随后，他们利用报告基因细胞系发现，用ALS-CSF处理能显著激活神经元样细胞和小胶质细胞中的NF-κB炎症信号通路，这为CSF的致病性提供了直接证据。

E6 antibody is internalized in cultured cells exposed to ALS-CSF（E6抗体在暴露于ALS-CSF的培养细胞中被内化）

在体外实验中，他们证明当细胞暴露于ALS-CSF时，E6抗体能够被神经元样细胞和小胶质细胞有效内化。重要的是，E6抗体主要分布在细胞质和包含病理性TDP-43的不溶性组分中，这与它的靶点位置一致。免疫沉淀实验进一步证实了E6抗体能够与脑脊液中的TDP-43结合。

I.t. delivery of E6 antibody improved motor performance and reduced spinal TDP-43 proteinopathy in mice infused with ALS-CSF（鞘内递送E6抗体改善了输注ALS-CSF小鼠的运动表现并减轻了脊髓TDP-43蛋白病）

通过鞘内途径给予E6抗体治疗，显著改善了ALS-CSF灌注小鼠的后肢和前肢步长，表明运动功能得到缓解。在组织学上，治疗减轻了脊髓运动神经元中TDP-43的胞质错误定位，并显著防止了运动神经元的丢失。

I.c.v. delivery of E6 antibody improved motor and cognitive performances of hTDP-43^WT mice infused with ALS-CSF（脑室内递送E6抗体改善了输注ALS-CSF的hTDP-43^WT小鼠的运动和认知表现）

为了同时靶向大脑和脊髓的病理变化，研究人员将E6抗体与ALS-CSF混合后直接进行脑室内共输注。他们首先证实了抗体能够有效扩散到大脑皮层和海马体。行为学测试表明，E6治疗不仅显著改善了小鼠的肌肉力量和步态，还挽救了由ALS-CSF诱导的认知缺陷，表现在新物体识别和被动回避测试中的表现更好。

I.c.v. delivery of E6 antibody reduced TDP-43 proteinopathy in motor cortex of hTDP-43^WT mice infused with ALS-CSF（脑室内递送E6抗体减轻了输注ALS-CSF的hTDP-43^WT小鼠运动皮层的TDP-43蛋白病）

免疫荧光和蛋白质生化分析显示，E6治疗显著提高了大脑皮层神经元中TDP-43的核质比，增加了可溶性TDP-43的水平，同时减少了不溶性TDP-43的聚集。同样，在脊髓中，E6治疗也保护了运动神经元免受死亡。

E6 antibody treatment reduced neuromuscular junction denervation and prevented neurofilament disorganization（E6抗体治疗减少了神经肌肉接头去神经支配并防止了神经丝结构紊乱）

对胫骨前肌的神经肌肉接头（NMJ）分析表明，ALS-CSF灌注会导致严重的NMJ去神经支配（完全失支配比例增加）。E6治疗虽然不能完全阻止支配丢失，但显著增加了部分支配的NMJ比例，减少了完全失支配的比例，表明其对神经肌肉连接有保护作用。同时，E6治疗还部分逆转了由ALS-CSF引起的神经丝轻链（NfL）的严重丢失和分布紊乱。

E6 antibody promoted beneficial microglial activation（E6抗体促进了有益的小胶质细胞激活）

研究发现，E6抗体治疗并未显著抑制由ALS-CSF诱导的小胶质细胞增生（Iba-1+细胞数量增加），但降低了大脑皮层中磷酸化p65（pp65）的水平。更重要的是，体外和体内实验均表明，E6治疗增强了小胶质细胞的吞噬功能（CD68表达增加），并使其分泌谱向抗炎方向转变，显著降低了多种促炎细胞因子（如CCL3/MIP-1α、LIX/CXCL5、GM-CSF、IFN-γ、TNF-α等）的释放。这表明E6抗体将小胶质细胞从有害的炎症状态“极化”为具有保护性、吞噬功能增强的状态。

结论与讨论

本研究得出结论，靶向TDP-43 RRM1结构域的单克隆抗体E6，能够有效缓解由散发性ALS患者脑脊液所触发的多种致病通路。无论是通过鞘内还是脑室内给药，E6治疗均能显著改善模型小鼠的运动和认知功能障碍，减轻TDP-43蛋白病理（包括其错误定位、聚集和功能丧失），保护脊髓运动神经元存活，维持神经肌肉接头的完整性，并逆转神经丝的网络结构破坏。

其重要意义在于，E6抗体可能通过多种机制发挥协同治疗作用。首先，抗体进入细胞后，直接结合胞质中的病理性TDP-43，可能通过招募TRIM21等蛋白促进其通过蛋白酶体途径降解，从而清除有毒聚集体，恢复TDP-43的核功能和RNA加工能力。这可能是NfL等下游靶蛋白表达恢复正常的基础。其次，E6抗体的Fc段与细胞表面的Fcγ受体相互作用，可能直接激活小胶质细胞的吞噬功能，同时减轻TDP-43本身引发的神经炎症，共同促使小胶质细胞向一种具有保护性的表型转化，这种有益的神经免疫调节对于遏制疾病进展至关重要。

该研究首次在模拟散发性ALS的疾病模型中验证了抗TDP-43免疫治疗的有效性，将之前仅限于家族性ALS模型的研究成果扩展到了更广泛的患者群体。研究结果强有力地表明，TDP-43是介导ALS-CSF毒性的一个关键核心分子，针对它的 immunotherapy（免疫治疗）策略，例如使用人源化后的E6抗体进行脑脊液内给药，有望发展成为对绝大多数ALS患者（包括散发性和家族性）均有效的全新治疗手段，为攻克这一顽疾带来了新的希望。