群体感应工具箱的扩展：启动子文库与杂交启动子助力动态遗传回路精准调控

本研究针对合成生物学中群体感应（QS）系统调控手段有限的问题，通过构建LasI/LasR和EsaI/EsaR系统的启动子文库（PlasI、PesaR/PesaS），开发了新型双输入杂交启动子（Phyb），实现了遗传回路表达强度的多维度精细调控，并成功设计出可区分生长阶段与两阶段生产的多级开关电路，为复杂动态调控系统提供了全新工具。

　　

在细菌世界中，群体感应（Quorum Sensing, QS）是一种普遍存在的细胞间通讯机制，通过分泌自诱导剂（Autoinducer, AI）来协调群体行为。近年来，基于N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactone, AHL）的QS系统因其结构简单、调控机制明确，已成为合成生物学领域构建动态遗传回路的重要工具。然而，现有QS系统的应用仍面临两大挑战：一是天然QS调控启动子的特性（如表达强度、泄漏表达、动态范围）难以满足多样化应用需求；二是缺乏能够同时响应多重信号的高级逻辑门控元件。

为突破这些局限，根特大学合成生物学中心的Jasmine De Baets等人在《New Biotechnology》发表研究，通过系统性的工程化改造，显著扩展了QS工具箱的功能性。研究团队聚焦于两种经过充分表征且正交性良好的QS系统——LasI/LasR（响应3OC12-HSL）和EsaI/EsaR（响应3OC6-HSL）系统，从启动子调控能力拓展和新型逻辑门构建两个维度开展了创新性探索。

研究主要采用了以下关键技术方法：1）通过随机化核心启动子间隔区序列构建启动子突变文库；2）利用微孔板荧光监测系统进行高通量启动子特性筛选；3）采用Golden Gate组装和CPEC克隆技术快速构建质粒组合；4）应用双报告基因（sfGFP/mKate2）系统同步监测双向启动子活性；5）通过响应曲面分析评估杂交启动子的逻辑门特性。

3.1. 群体感应调控启动子文库

研究团队首先针对P_lasI启动子的17核苷酸间隔区进行随机化，构建了容量达1.7×10¹⁰的突变文库。筛选发现大多数变异体活性显著降低，但成功获得5个动态范围＞4.9的功能性变异体，其最大活性较野生型降低4-49倍。对EsaI/EsaR系统的双向启动子P_esaR/P_esaS则设计了三种随机化策略：单独突变P_esaR间隔区（8核苷酸）、P_esaS间隔区（13核苷酸）以及双区同时突变（21核苷酸）。最终获得的68个优选变异体呈现出丰富的表达特性：P_esaR动态范围达1.8-99，最大活性为野生型的0.13-12.7倍；P_esaS动态范围为2.6-81，最大活性为野生型的0.08-2.2倍。这些启动子文库为精细调控基因表达提供了丰富资源。

3.2. 杂交启动子

研究人员创新性地将LasR结合位点（las-box）与EsaR结合位点（esa-box）整合，构建了首例由两种QS系统协同调控的杂交启动子。该设计利用EsaR在无自诱导剂时的阻遏功能（位于转录起始点+5bp）和LasR在有自诱导剂时的激活功能（位于-40区），实现了严格的AND逻辑门控制。经过正交化改造（P_hyb(orth)）和点突变优化（P_hyb(AC)），成功将3OC6-HSL诱导的泄漏表达从10%降低到5%以下，同时保持了对双自诱导剂协同响应的高敏感性（10μM 3OC6-HSL+10μM 3OC12-HSL时激活最强）。

3.3. 多级开关

为展示新元件的应用潜力，研究团队设计了一个三级动态调控系统：第一阶段细菌正常生长，Las系统产生3OC12-HSL；当达到阈值后启动第二阶段，激活P_lasI表达EsaR/EsaI，同时P_esaS驱动sfGFP表达；当3OC6-HSL积累至阈值时进入第三阶段，EsaR解除对P_hyb的抑制，启动mKate2表达而关闭sfGFP生产。通过选用弱化版P_{lasI_2}启动子（降低EsaI表达）和强化EsaR翻译（更换RBS序列），成功实现了生产阶段的时序分离，但最终输出效率受限于静止期基因表达抑制现象。

该研究通过系统性的元件工程化改造，显著拓展了QS工具箱的调控维度和应用场景。启动子文库的建立使研究人员能够根据需求精准选择不同特性的调控元件，而杂交启动子的成功构建则为复杂逻辑回路设计提供了新范式。多级开关电路的初步实现证明了这些元件在动态调控系统中的实用价值，尽管静止期表达抑制等问题仍需进一步优化。这些成果不仅为合成生物学提供了可预测、可调谐的遗传控制元件，也为代谢工程、生物制造等领域的多阶段精准调控奠定了技术基础。