绿藻磷酸丙糖异构酶Cys219位点的S-亚硝基化调控机制及其在碳代谢中的保守性研究

本研究针对绿藻磷酸丙糖异构酶（TPI）的S-亚硝基化调控机制不明的问题，通过分子对接、晶体结构解析和突变体功能分析，发现Cys219是GSNO依赖的活性调控关键位点，揭示了其在碳代谢中的保守调控策略，为理解氧化还原信号整合代谢途径提供了新视角。

　　

在细胞信号传导和代谢调控中，蛋白质的翻译后修饰扮演着关键角色。其中，S-亚硝基化（S-nitrosylation）作为一种可逆的氧化还原修饰，通过在一氧化氮（NO）与蛋白质半胱氨酸残基之间形成亚硝基硫醇（-SNO），动态调节蛋白质的功能和稳定性。这种修饰在植物和非植物系统中广泛存在，尤其在响应生理或应激刺激时，能够作为分子开关精细调控代谢通路。然而，尽管多种生物体内的磷酸丙糖异构酶（Triosephosphate isomerase, TPI）已被鉴定为潜在的S-亚硝基化靶点，但其具体的分子机制、关键修饰位点以及功能影响仍不清楚。TPI是糖酵解和卡尔文-本森-巴沙姆（Calvin-Benson-Bassham, CBB）循环中的核心酶，催化二羟基丙酮磷酸（DHAP）和甘油醛-3-磷酸（G3P）的可逆转化，对碳固定和能量代谢至关重要。因此，阐明TPI的氧化还原调控机制，不仅有助于理解基础细胞生物学过程，还可能为改善光合效率和应对环境胁迫提供新策略。

以往的研究主要依赖于蛋白质组学筛选，缺乏功能验证和结构生物学支持。例如，在植物和人类细胞中，TPI的S-亚硝基化已被多次报道，但只有人类TPI（HsTPI）和莱茵衣藻TPI（CrTPI）的调控作用得到初步证实。其中，CrTPI作为一种特殊的单基因编码酶，同时参与叶绿体内的糖酵解和光合作用，是研究氧化还原调控的理想模型。此前的研究表明，CrTPI的活性受亚硝基谷胱甘肽（GSNO）抑制，但其分子基础尚未揭示。为了填补这一空白，本研究综合运用计算模拟、结构生物学和生物化学方法，系统探索了CrTPI的S-亚硝基化机制，并鉴定出关键功能位点。

研究人员主要采用了分子对接技术（AutoDock VINA）预测GSNO与CrTPI的相互作用位点，通过X射线晶体学解析了GSNO处理后的CrTPI结构（分辨率达1.2–1.55 ?），并利用位点定向突变（Cys-to-Ser）结合酶动力学分析评估了突变体的活性和氧化还原敏感性。此外，分子动力学模拟（AMBER 22）和结合能计算（MM-GBSA）用于评估硝基化半胱氨酸的稳定性及其局部相互作用。样本来源于重组表达的CrTPI蛋白及其突变体（C14S和C219S），所有实验均至少三次生物学重复，数据以均值±标准差表示，并采用t检验或ANOVA进行统计分析。

研究结果部分如下：

3.1. 半胱氨酸残基的保守性、可及性和反应性

CrTPI二聚体每个亚基含有5个半胱氨酸残基（Cys14、Cys126、Cys194、Cys219和Cys247），其中仅Cys126和Cys219在人类TPI中保守。溶剂可及性分析显示，在二聚体构象中，仅Cys219暴露于溶剂，但DTNB滴定实验表明，还原态CrTPI中约有4个硫醇基团具有反应性，提示蛋白在溶液中可能存在构象动态变化。

3.2. 分子对接揭示GSNO可能与Cys14和Cys219邻近位点相互作用

对接分析表明，在二聚体状态下，GSNO优先结合Cys219附近（结合能ΔG_binding = –16.6 kcal mol^–1）；而在单体构象中，Cys14位点结合更强（ΔG_binding = –18.4 kcal mol^–1）。这提示二聚化可能影响Cys14的可及性。

3.3. S-亚硝基化CrTPI的晶体结构揭示Cys14形成亚硝基硫醇

GSNO浸泡的CrTPI晶体结构显示，Cys14被S-亚硝基化，并呈现双构象态，其中主要构象（占67%）通过π堆积和氢键（与Val78、Ser79）稳定。未观察到Cys219或其他位点的修饰，可能由于晶体堆积限制其可及性。

3.4. Cys14和Cys219突变体的功能与结构特征

C14S突变体活性降低至WT的80%，但二聚体结构和圆二色谱（CD）未见显著改变；C219S则保持全活性。晶体结构显示C14S突变未改变整体折叠，但动态光散射（DLS）表明其易形成寡聚体。

3.5. CrTPI野生型及Cys突变体对氧化处理的响应

DTNB处理表明，C219S突变体敏感性降低（30分钟后残留活性40%），而C14S与WT类似。GSNO处理时，WT活性抑制50%，C14S抑制增强（60%–80%），而C219S完全丧失敏感性，证明Cys219是GSNO依赖调控的关键位点。

3.6. 分子动力学计算评估S-亚硝基硫醇的稳定性与相互作用

MM-GBSA分解分析显示，Cys14-SNO的结合能变化（–5.9 kcal mol^–1）大于Cys219-SNO（–2.0 kcal mol^–1），且Cys14-SNO通过更多氢键网络稳定，与晶体结果一致。

3.7. S-亚硝基化调控CrTPI的分子基础

Cys219（对应人类TPI的Cys217）的修饰可能通过长程相互作用影响底物结合位点（如Gly234、Gly235和Ile246），间接抑制催化活性，表明其调控机制在进化上保守。

研究结论与讨论部分强调，本研究首次通过实验证实CrTPI的S-亚硝基化主要由Cys219介导，尽管晶体中仅捕获到Cys14修饰。功能上，Cys219的氧化还原敏感性对GSNO依赖的活性抑制至关重要，且该机制与人类TPI保守，提示其在跨物种代谢调控中的普遍性。此外，Cys14的修饰虽在结构上稳定，但不直接贡献于活性调控，反而可能通过影响二聚体界面灵活性间接调节酶功能。这些发现深化了对氧化还原信号整合碳代谢的理解，并为针对TPI的农艺或医学应用（如改善光合效率或治疗代谢疾病）提供了分子靶点。未来研究可探索其他氧化修饰（如S-谷胱甘化）对TPI的调控作用，以及其在应激条件下的生理意义。