CDK4/6-RB信号通路通过时间调控人类DNA复制许可揭示癌症治疗新靶点

为解决DNA复制起始调控机制不清的问题，研究人员开展CDK4/6-RB信号通路调控复制许可的研究，发现CDK4/6活性通过拮抗RB蛋白促进MCM复合物加载，抑制CDK4/6可阻断复制起始并诱导p53缺陷细胞发生未复制DNA的有丝分裂，为癌症治疗提供新策略。

　　

在细胞生命活动中，DNA复制和细胞分裂的精确协调对维持组织稳态和基因组稳定性至关重要。DNA复制起始包括复制起点许可（origin licensing）和起点 firing 两个关键步骤。起点许可发生在G₁期，涉及微型染色体维持（minichromosome maintenance, MCM）解旋酶复合物通过CDC6、CDT1和起点识别复合物（origin recognition complex, ORC）加载到DNA上。传统观点认为CDK活性会抑制复制许可，尤其是在酵母模型中，但人类细胞中存在多种细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases, CDKs），其功能更为复杂。CDK4/6抑制剂如palbociclib在乳腺癌治疗中显示出显著疗效，但其作用机制是否涉及复制许可调控尚不清楚。此外，视网膜母细胞瘤（retinoblastoma, RB）蛋白家族作为CDK4/6的主要底物，如何影响复制起始过程也有待阐明。

为了回答这些问题，研究人员在《Nature Communications》上发表了最新研究成果，通过结合快速蛋白降解技术和时间分辨的EdU测序（EdU-sequencing）方法，揭示了CDK4/6-RB信号通路在人类DNA复制许可中的关键作用。

研究主要采用了以下几种关键技术方法：一是利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建了可诱导降解CDC6和CDT1的双降解标签（mAID-SMASh）细胞模型（RPE CDC6^d CDT1^d）；二是通过定量图像细胞术（quantitative image-based cytometry, QIBC）和染色质分级分析监测MCM复合物的加载情况；三是应用时间分辨的EdUseq技术在全基因组范围绘制复制起点 firing 的动态图谱；四是利用CDK4/6抑制剂（palbociclib、Trilaciclib）和PROTACs分子研究激酶功能；五是通过等基因RB缺陷细胞模型验证RB蛋白家族在复制许可中的功能。

Results

Turning off origin licensing within one cell cycle

研究人员首先建立了可快速降解CDC6和CDT1的RPE细胞模型。通过添加asunaprevir (ASV)和1-萘乙酸 (NAA) 的ADN药物组合，可在单细胞周期内实现CDC6和CDT1的高效降解（4小时内蛋白水平不可检测）。降解这两个关键加载因子后，染色质结合的MCM2和MCM3水平显著降低，而ORC2保持不变。重要的是，CDC6和CDT1的降解并不引发DNA复制应激标志物（如γH2AX或RPA超磷酸化）的激活，也不影响细胞周期进程，细胞仍能进入有丝分裂，但出现无姐妹染色单体的异常分裂现象。

通过时间分辨的实验设计，研究人员发现复制许可在整个G₁期持续进行，而非局限于特定时间段。在G₁期不同时间窗口施加ADN处理均能降低EdU掺入水平，且EdUseq分析显示早期和晚期G₁期的处理对复制起点活性的抑制程度相似，表明大多数起点没有明显的早晚许可偏好。

CDK4/6 inhibition stalls origin licensing through RB

接下来，研究人员探讨了CDK4/6活性在复制许可中的作用。短期（8-18小时）CDK4/6抑制剂（palbociclib或Trilaciclib）处理显著降低了染色质结合的MCM2和MCM6水平，而不影响总MCM蛋白量。这种抑制效应在mimosine阻滞的G₁期细胞中更为明显，且不能被蛋白酶体抑制剂MG132所逆转，表明CDK4/6通过调控MCM加载而非蛋白稳定性来影响复制许可。

通过使用RB1缺陷、RB1/RBL1/RBL2三敲除细胞以及乳腺癌细胞模型，研究人员证实CDK4/6抑制剂对复制许可的抑制作用依赖于RB蛋白家族。在RB缺陷细胞中，palbociclib对MCM加载的抑制效应被显著缓解。此外，CDK4/6的PROTAC降解剂也引起类似的许可缺陷，但palbociclib在抑制RB磷酸化方面更为有效，提示CDK4/6蛋白的存在本身可能通过非催化功能参与调控。

RB blocks origin licensing independent of E2F-driven CDC6, CDT1 or MCM6 expression

为排除E2F依赖的转录调控的作用，研究人员发现CDK4/6抑制虽然降低了核CDC6水平，但这一效应不依赖RB状态。在可诱导过表达CDC6或CDT1的细胞模型中，提高这两个加载因子的表达量并不能挽救palbociclib引起的MCM加载缺陷。此外，RB的E2F结合缺陷突变体（RB^661W）仍能抑制复制许可，表明RB通过E2F非依赖的机制直接阻碍MCM复合物的染色质招募。研究人员还发现MCM7羧基末端（MCM7-CT）的过表达可模拟RB的抑制效应，进一步支持了RB与MCM复合物之间存在直接相互作用的模型。

CDK4/6 inhibitor-induced licensing defects can be perpetuated to cause mitosis with unreplicated DNA

由于人类细胞在G₁期许可的起点数量远超实际 fired 的数量，研究人员想知道CDK4/6抑制是否影响功能性复制起点的形成。通过在palbociclib释放的同时降解CDC6和CDT1，他们发现DNA合成几乎完全被抑制，但细胞仍能进入有丝分裂，产生无复制DNA的异常分裂。类似的结果在使用ORC-DNA结合抑制剂RL5a的实验中得到验证。生化分析显示，这种处理条件下染色质结合的PCNA减少，MCM4和MCM2 Ser53位点的磷酸化（DDK底位点）水平降低，表明MCM双六聚体的形成和激活受阻。

CDK4/6 activity is required at the time of origin licensing

最后，研究人员通过时间分辨的EdUseq实验探讨了CDK4/6活性的时序需求。在G₁期早期（0-4小时）或晚期（4-14小时）施加palbociclib处理均能显著降低复制起点活性，且早期抑制的效果更为明显。当CDK4/6抑制与CDC6/CDT1降解在G₁期交替进行时，起点活性的抑制呈现叠加效应，表明CDK4/6活性和MCM加载机器需要在同一时间发挥作用才能实现高效复制许可。

Discussion

本研究颠覆了传统认为CDK活性仅负调控复制许可的观点，揭示了人类细胞中CDK4/6-RB轴通过促进复制许可来协调细胞周期进程和DNA复制的新机制。研究人员发现CDK4/6活性通过拮抗RB蛋白家族的功能，促进MCM复合物和ORC6的染色质加载，这一过程不依赖于E2F介导的CDC6、CDT1或MCM6转录调控。更重要的是，CDK4/6抑制导致的许可缺陷可用于选择性诱导p53缺陷细胞发生未复制DNA的有丝分裂，为癌症治疗提供了新的策略。

这些发现不仅解释了CDK4/6抑制剂在临床治疗中的有效性，也为克服耐药性提供了新思路。研究表明，RB缺失的肿瘤细胞虽然能够抵抗CDK4/6抑制剂的细胞静止效应，但其复制许可仍然处于亚optimal状态，这为联合使用CDK4/6抑制剂和复制应激诱导剂治疗RB缺陷癌症提供了理论依据。

从进化角度，研究人员提出CDK4/6-RB轴的独特功能可能满足了多细胞动物对细胞增殖和分化精细调控的需求，确保在快速分裂组织中实现完整的基因组复制，同时避免终末分化细胞中不必要的能量消耗。该研究为理解细胞周期调控、DNA复制起始和癌症治疗提供了重要见解，相关发现对开发新型抗癌疗法具有深远意义。