综述：下一代工具在癌症神经科学中的应用

本综述系统梳理了癌症神经科学领域的前沿技术，包括单细胞/空间转录组学（scRNA-seq/spatial transcriptomics）、光遗传学（optogenetics）、化学遗传学（chemogenetics）及神经活动追踪技术（如TRAP2和Trace-n-seq）。重点探讨了这些工具如何揭示神经系统与肿瘤微环境（TME）的双向互作机制，特别是神经元通过神经肽（如CGRP）、神经递质和电活动调控免疫细胞（如T细胞耗竭）和肿瘤进展的过程，为靶向神经-癌症互作的新型治疗策略提供了技术支撑。

　　

癌症神经科学：新兴的交叉学科领域

传统上，肿瘤学与神经科学的交叉研究主要集中在癌细胞沿神经侵袭（perineural invasion, PNI）的现象。然而，近年研究发现，周围神经系统与癌症之间存在双向调控，共同影响疾病进展。癌症神经科学因此诞生，整合了神经科学、肿瘤学、发育生物学、免疫学等多学科知识，旨在深入探究神经与癌症的复杂相互作用。这一领域的进展依赖于多组学技术（如基因组学、转录组学、蛋白质组学）以及高分辨率成像工具的应用，这些技术有助于解析肿瘤微环境（TME）中神经、免疫和血管系统的交互网络。

监测神经元对TME细胞影响的工具

高维流式细胞术

光谱流式细胞术能够同时检测30-40种细胞标记物，通过捕获荧光染料的完整发射光谱，实现高通量免疫表型分析。该技术已用于揭示神经元活动（如伤害性感受器激活）如何重塑肿瘤免疫 landscape，例如在黑色素瘤模型中，伤害性感受器消融可改变T细胞耗竭状态。尽管该技术缺乏空间信息，但其高通量和低成本特性使其适用于大规模纵向研究。

荧光激活细胞分选（FACS）

FACS可用于从背根神经节（DRG）和迷走神经节（VG）中分离特定神经元或基质细胞群体，结合Cre-lox报告系统，获得高纯度细胞用于下游转录组、电生理或蛋白质组分析。然而，感觉神经元在分选过程中易受损，且缺乏特异性标记物，限制了其应用。

单细胞转录组学（scRNA-seq）

scRNA-seq能够解析肿瘤等复杂组织中的细胞异质性，揭示神经元信号如何转录重编程肿瘤相关免疫细胞。例如，通过scRNA-seq发现免疫细胞亚群选择性表达神经肽和神经递质受体，促进了细胞特异性敲除工具的开发。结合逆行追踪技术（如Trace-n-seq），scRNA-seq还可用于分析肿瘤相关神经元的异质性。

空间转录组学

空间转录组学技术（如10x Genomics Visium、NanoString GeoMx DSP）可在组织原位绘制RNA表达图谱，揭示神经纤维附近免疫调节基因（如IL-10、PD-L1）的表达梯度。在胰腺导管腺癌中，该技术发现神经浸润区域高表达神经元损伤反应基因和免疫抑制标记物。不同平台的分辨率和基因覆盖度各异，需根据研究问题选择合适技术。

共培养系统

共培养系统用于研究神经元与免疫细胞或肿瘤细胞的直接相互作用（通过物理接触）或间接旁分泌信号（通过Transwell或条件培养基）。结合光遗传学或化学遗传学工具，可实时监测钙离子 flux（如GCaMP传感器）或神经递质释放（如GRAB传感器）。然而，体外系统无法完全模拟体内TME的复杂性，结果解释需谨慎。

活体显微镜（IVM）

IVM技术通过荧光标记（如基因编码报告基因或染料）实时观察活体组织中细胞的迁移、信号传递和组织重塑。结合神经元特异性操纵（如化学遗传学或光遗传学），IVM可用于研究神经元对肿瘤内免疫细胞行为的调控。目前，IVM尚未直接应用于TME中神经-免疫互作的可视化。

全组织免疫标记与组织透明化

传统薄层切片难以完整显示轴突在肿瘤中的分布。全组织免疫标记结合组织透明化技术（如CLARITY、CUBIC、iDISCO）可实现三维成像，清晰展示神经纤维在肿瘤中的架构。扩展显微镜（ExM）通过水凝胶膨胀样品，达到超分辨率成像，用于精细映射蛋白质和RNA分布。人工智能辅助分析（如TriPath平台）可自动量化肿瘤相关结构（如血管、神经纤维）。

操纵神经功能以调控TME的工具

体内化学遗传学与光遗传学

光遗传学利用光敏感蛋白（如channelrhodopsin-2）精确控制神经元活动，具有毫秒级时间分辨率和空间特异性。在脑瘤模型中，光遗传激活特定神经元群体可促进胶质瘤 initiation 和进展（如通过neuroligin-3分泌）。化学遗传学（如DREADDs）通过设计受体（如hM3Dq）被小分子（如CNO）激活，实现长时间神经调制。新开发的HCAD系统靶向周围神经系统，减少中枢副作用。这些技术证实，驱动特定神经元电活动可直接改变肿瘤行为（如生长速率）。

功能性神经生理学技术：钙成像与膜片钳

钙成像（如GCaMP）和膜片钳记录用于检测神经元兴奋性和突触传递。在癌症模型中，肿瘤衍生因子（如纤维肉瘤条件培养基）可敏化DRG神经元，导致钙瞬变增大和Ca²⁺通道亚基上调。膜片钳技术直接测量离子电流和膜电位，在胶质瘤中发现肿瘤细胞与神经元形成功能性突触（通过PSD-95和synapsin标记）。化学遗传激活感觉神经元可诱发肿瘤细胞钙信号，双向通讯机制得到验证。

经验依赖范式

行为学范式（如感觉刺激、运动学习）可诱导生理性神经环路活动，影响肿瘤 pathophysiology。例如，嗅觉刺激通过IGF1信号促进胶质瘤发生，而环境丰富化抑制胶质瘤生长。这些范式需结合遗传和神经调制工具以解析特定神经元贡献。

定义肿瘤如何影响神经系统功能的工具

追踪神经元活动的遗传工程小鼠

立即早期基因（如cFos）免疫荧光可用于检测神经元活动，但仅提供瞬时 snapshot。TRAP2小鼠模型通过Fos启动子驱动CreER表达，在他莫昔芬诱导下标记活动神经元（如tdTomato报告基因），从而追溯神经元活动历史。该技术尚未广泛应用于癌症神经科学，未来可用于研究肿瘤诱导的神经环路重塑。

评估疼痛或认知缺陷的行为学检测

癌症及其治疗（如化疗、免疫疗法）可导致认知障碍（如记忆减退、执行功能下降）和疼痛。机械 allodynia（von Frey filaments）、热 hyperalgesia（Hargreaves test）和 grimace scales 用于量化疼痛。新奇物体/位置识别测试评估记忆功能， puzzle box test 检测执行功能。需注意整体健康状态对行为的混淆影响。

Trace-n-seq追踪癌症相关周围神经元

周围神经元的胞体远离肿瘤，常规测序难以捕获。Trace-n-seq结合快速逆行示踪剂（如Fast Blue）和优化细胞分离 protocol，从外周神经节中分离肿瘤浸润神经元进行scRNA-seq。在胰腺癌中，该技术揭示交感神经和感觉神经的重编程，以及神经元与癌症相关成纤维细胞（CAFs）、免疫细胞的互作。去神经支配（手术或药理）可抑制肿瘤生长并增强免疫应答。

结论

多组学、高分辨率成像、遗传工程和精细化模型的发展，正推动癌症神经科学领域深入探索神经-肿瘤互作的时空调控机制。轴突 ingrowth 可能成为癌症的新特征，跨学科合作和技术创新将促进实验室发现向临床转化。未来需开发更精确的人神经元操纵工具，以解析神经活动在肿瘤休眠、进展、免疫逃逸和治疗抵抗中的作用，最终改善患者生活质量。