加帽蛋白调控神经祖细胞形态与命运决定促进哺乳动物新皮层发育的机制研究

本研究聚焦于新皮层发育过程中神经祖细胞增殖与分化的分子调控机制，发现肌动蛋白相关加帽蛋白家族（ADD1-3）通过调控基底祖细胞（BP）形态复杂性（原突数量与分支）和顶端祖细胞（AP）有丝分裂纺锤体取向，影响神经祖细胞增殖能力与神经元产出。研究人员利用小鼠、雪貂体内模型及人皮层类器官开展功能实验，证实ADDs缺失导致BP数量减少和神经发生异常，而过表达则促进BP增殖与神经元生成。该研究揭示了ADDs在哺乳动物新皮层扩张中的关键作用，为相关神经发育疾病提供分子机制见解。

　　

哺乳动物新皮层的进化扩张是高级认知功能的基础，这一过程主要依赖于神经祖细胞（NPCs）增殖能力的增强。然而，调控顶端祖细胞（APs）和基底祖细胞（BPs）增殖的分子机制尚不完全清楚。尤其在物种间比较中，BPs的丰度和形态复杂性存在显著差异：人类、雪貂等新皮层扩张物种的BPs具有更多细胞突触，从而更有效地感知促增殖信号并维持细胞周期重新进入，而小鼠等新皮层较小的物种中BPs增殖能力有限。此前研究发现PALMD（一种形态调控分子）可调节人类BPs的突触数量，且其与加帽蛋白（Adducins, ADD1-3）形成复合物，提示ADDs可能在新皮层发育中发挥重要作用。ADDs基因变异与多种神经发育障碍相关，包括皮质发育畸形、智力障碍和脑性瘫痪，进一步支持了其在神经系统发育中的潜在重要性。

为了深入探究ADDs在神经发生过程中的功能，研究人员综合运用了小鼠和雪貂体内模型以及人皮层类器官技术。通过CRISPR/Cas9介导的基因敲除（KO）和过表达（OE）实验，结合免疫荧光染色、细胞周期分析、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和细胞形态定量分析等方法，系统评估了ADDs对神经祖细胞增殖、分化、形态和纺锤体取向的影响。

ADDs在发育中新皮层的表达谱

研究人员首先检测了ADDs在小鼠、雪貂和人皮层类器官发育过程中的表达模式。所有三种ADDs（ADD1、ADD2和ADD3）均在发育中的新皮层表达，其中ADD1广泛表达，ADD2在神经元中富集，ADD3则在神经祖细胞中显著表达。免疫荧光染色证实了这些蛋白在胚胎皮层组织中的定位，提示它们可能参与神经发生的多个方面。

ADDs调控雪貂胚胎新皮层中基底祖细胞的丰度

通过子宫内电穿孔介导的CRISPR/Cas9基因编辑，研究人员在雪貂胚胎新皮层中实现了ADDs的三重敲除（triple ADDs KO）。结果显示，ADDs缺失导致SVZ中SOX2⁺ BPs（ likely bRG）的减少，而TBR2⁺ bIPs则增加。同时，细胞周期标志物Ki67⁺的细胞数量减少，表明增殖能力受损。形态学分析进一步发现，ADDs缺失的BPs具有更少的原发和总突触、更短的突触长度以及更低的分支复杂性，证实ADDs是维持BP形态和增殖所必需的。

ADDs调控小鼠胚胎新皮层中基底祖细胞的丰度

类似地，在小鼠胚胎中进行ADDs三重敲除也导致了SVZ中Sox2⁺ Tbr2⁺ BPs的减少，且BP的形态复杂性显著降低。尽管细胞周期重新进入实验（Edu脉冲追踪）未显示显著差异，但增殖细胞的数量减少，表明ADDs在小鼠BP生物学中同样发挥重要作用。

ADDs促进小鼠胚胎新皮层中基底祖细胞的丰度

研究人员进一步探讨了ADDs过表达的影响。由于ADDs以异源二聚体形式发挥作用，其中ADD1是必需伙伴，他们共表达了ADD1与ADD2（ADD1/2 OE）或ADD1与ADD3。ADD1/2 OE显著增加了SVZ中Sox2⁺ Tbr2⁺ BPs的数量，并提高了pVIM⁺有丝分裂细胞的比例。细胞周期重新进入实验（Edu和BrdU双标记）证实，ADD1/2 OE增强了BPs的增殖能力，而不影响APs的细胞周期重新进入。

ADDs促进基底祖细胞突触的生长和小鼠神经发生

形态学分析显示，ADD1/2 OE增加了BPs的原发和总突触数量以及分支指数，而不影响突触长度。这种形态复杂性的增加与增殖能力的增强一致。进一步，在E18.5胚胎中，ADD1/2 OE导致了Ctip2⁺ layer V神经元数量的增加，以及上层层神经元（Satb2⁺）的持续产生，表明ADDs过表达通过增强BP增殖能力促进了神经元输出。

ADD1是人皮层类器官中祖细胞丰度和正确组织所必需的

为了研究ADDs在人类神经发生中的作用，研究人员利用CRISPR/Cas9在H9多能干细胞中构建了ADD1 KO细胞系，并衍生出皮层类器官。ADD1 KO导致所有三种ADD蛋白的缺失，并引起类器官中Ki67⁺循环细胞和SOX2⁺ NPCs的减少，特别是在VZ和SVZ区域。进一步分析显示，SOX2⁺ TBR2^? APs和BPs（ likely aRG和bRG）特异性减少，而TBR2⁺细胞的位置发生异常，类组织结构紊乱。通过ADD1表达 rescue实验，成功恢复了SOX2⁺ NPCs的丰度，证实了表型的特异性。

ADD1是正确进行人类神经发生所必需的

scRNA-seq分析揭示，ADD1 KO类器官中出现了一个新的神经元亚群（Neurons 3），该群细胞表达未成熟神经元和突触标志物，但表达水平较低，且呈现内质网（ER）应激反应特征（如CHOP表达增加）。伪时间分析表明，Neurons 3处于分化轨迹的中间状态，可能直接来源于RG而非IPCs。转录组差异表达分析显示，ADD1 KO在RG集群中引起与细胞形态发生和神经元分化相关的基因下调，以及细胞粘附相关基因的上调，提示ADD1缺失通过影响RG的生物学功能导致神经发生异常。

ADDs通过调控APs的纺锤体取向和BPs的形态 underlying人类神经发生

亚聚类分析将RG分为aRG和bRG群，发现ADD1 KO在aRG中主要影响细胞粘附相关基因，而在bRG中影响细胞形态和神经发生相关基因。进一步实验证实，ADD1 KO类器官中垂直分裂的比例减少，斜向分裂增加，导致APs池的耗竭和子代细胞命运的改變。单细胞微注射追踪实验显示，ADD1 KO子代细胞距离脑室更远，顶端附着减少，SOX2⁺ TBR2^?子代减少。此外，ADD1 KO类器官的BPs表现出突触数量减少，形态复杂性降低，与小鼠和雪貂中的发现一致。

本研究系统阐明了ADDs在哺乳动物新皮层发育中的多重调控功能。首先，ADDs通过维持BPs的形态复杂性（突触数量和分支）增强其感知微环境信号的能力，从而促进增殖；其次，ADDs通过调节APs的纺锤体取向影响对称/不对称分裂的命运决定，确保祖细胞池的维持和BPs的正确生成。这些机制在小鼠、雪貂和人类模型中均得到验证，突出了ADDs在物种间保守而又差异的功能。研究结果不仅揭示了新皮层扩张的细胞分子基础，也为ADDs相关神经发育疾病（如脑性瘫痪、皮质发育畸形）提供了潜在的病理机制解释。值得注意的是，ADD1作为复合物的核心成分，其缺失会引起广泛的分子和细胞表型，而物种间差异（如BP增殖能力和谱系进展）可能解释了为何某些ADDs变异在人类中导致严重皮质畸形，而在小鼠中仅表现为轻微结构异常。未来研究可进一步探索ADDs如何与微环境信号（如ECM成分）相互作用，以及其在神经元迁移和成熟中的可能作用。