内溶酶体功能障碍通过破坏蛋白质稳态在体内诱发神经退行性变及TDP-43蛋白病理

本研究针对神经退行性疾病中内溶酶体系统功能障碍如何导致TDP-43蛋白病理这一关键问题，构建了表达组成型活性Rab5Q79L的AAV9小鼠模型。研究发现该模型可重现内溶酶体扩大、自噬-溶酶体系统异常、泛素/p62包涵体形成等病理特征，并首次在体内证明内溶酶体功能障碍足以诱发pTDP-43聚集、神经元丢失、神经炎症及核孔复合体异常。该模型为研究FTD-ALS等疾病的早期病理机制提供了重要工具，揭示了内溶酶体系统作为治疗干预靶点的潜在价值。

在神经退行性疾病研究领域，额颞叶痴呆（FTD）和肌萎缩侧索硬化（ALS）等疾病中存在一个显著的共同病理特征——TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）的异常磷酸化和胞质聚集。虽然TDP-43蛋白病理已被确认为关键标志，但其上游驱动因素和分子起始事件仍不明确。近年来，内溶酶体系统（endolysosomal system）的功能障碍逐渐被认为是神经退行性病变的早期事件。这个系统负责细胞内的物质运输、分选和降解，其功能紊乱可能导致多种致病蛋白的异常积累。事实上，在阿尔茨海默病（AD）、FTD-ALS等多种疾病中，都观察到了内体扩大、溶酶体形态异常等内溶酶体系统失调的现象。特别值得注意的是，多个与FTD-ALS相关的致病基因，如C9orf72、TBK1、GRN等，其编码蛋白都在内溶酶体途径中发挥重要功能，这进一步暗示了该系统在疾病发生中的关键地位。

在调控内溶酶体系统的众多分子中，Rab5 GTP酶处于核心位置。它是早期内体的标志蛋白，调控内体的融合与运输过程。研究人员此前发现，Rab5的功能异常与多种神经退行性疾病相关，可能导致内体扩大，进而阻碍关键蛋白质的正常运输。更引人注目的是，一种组成型活性突变体Rab5^Q79L（其79位谷氨酰胺被亮氨酸取代）能够在细胞模型中诱导TDP-43的错误定位和聚集，这为理解内溶酶体功能障碍与TDP-43病理之间的联系提供了初步线索。然而，这种突变蛋白在活体动物中是否能够引发全面的神经退行性病理变化，特别是能否诱导出TDP-43蛋白病理、神经炎症和行为缺陷等关键表型，仍然是一个悬而未决的问题。

为了解决这一重要问题，Wei Shao、Ellen A. Albagli、Karen Jansen-West等研究人员在Leonard Petrucelli和Yong-Jie Zhang的领导下，开发了一种新型的转基因小鼠模型。他们使用腺相关病毒（AAV9）载体介导，在新生小鼠中枢神经系统中选择性表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的Rab5^Q79L突变蛋白，从而在体内模拟内溶酶体系统的持续激活状态。通过这一精巧的模型，研究团队首次在活体动物中系统研究了内溶酶体功能障碍对蛋白质稳态、神经细胞存活和行为功能的全面影响，相关成果发表在《iScience》期刊上。

在研究技术方法层面，作者团队主要通过AAV9病毒载体构建与注射（介导GFP-Rab5^Q79L在小鼠中枢神经系统的表达）、小鼠行为学测试（包括后肢 clasping 测试和悬挂 wire 测试）、组织免疫染色（免疫组化与免疫荧光分析内体标志物EEA1、溶酶体标志物CatD、泛素、p62、pTDP-43等的表达与分布）、蛋白质免疫印迹（检测Rab5与GFP蛋白表达水平）以及电子显微镜（观察内体与溶酶体超微结构）等多种技术手段，对模型小鼠的表型进行了多角度、多层次的分析。

研究结果部分揭示了多个重要发现：

GFP-Rab5^Q79L小鼠表现出运动缺陷

研究人员首先对模型小鼠进行了行为学分析。在30日龄时，GFP-Rab5^Q79L小鼠就开始表现出显著的后肢紧握异常，这种运动缺陷随着时间推移逐渐加重。在三个月大时进行的悬挂钢丝测试中，突变小鼠的平均坠落次数显著高于对照组（13次对比2次）。Western blot分析证实Rab5总蛋白水平（内源加外源）约为对照组的2倍，且行为缺陷的严重程度与Rab5^Q79L表达水平呈正相关。这些结果表明，神经元中Rab5^Q79L的适度表达就足以引发早期且 robust 的运动表型。

Rab5^Q79L诱导内体扩大和异常溶酶体形态，重现内溶酶体功能障碍

通过免疫荧光标记早期内体标志物EEA1，研究发现GFP-Rab5^Q79L小鼠皮层中的内体尺寸增加了约10倍。同时，溶酶体标志物Cathepsin D（CatD）的染色显示约30%的细胞中存在异常的CatD阳性斑块，而在表达GFP-Rab5^Q79L的细胞中，这一比例高达60%。电子显微镜观察进一步证实了突变小鼠脑中存在扩大的早期内体和内溶酶体，表明内溶酶体系统发生了严重 disruption。

GFP-Rab5^Q79L小鼠表现出蛋白质稳态缺陷

由于内溶酶体系统在蛋白质降解中起核心作用，研究人员接下来检测了蛋白质稳态指标。研究发现突变小鼠中泛素阳性聚集物显著增加，约20%的细胞存在泛素包涵体，而在表达Rab5^Q79L的细胞中，这一比例高达85%。同时，自噬标志物p62的聚集也更加明显，约45%的细胞存在p62阳性聚集，在表达突变蛋白的细胞中比例高达95%。值得注意的是，部分p62聚集物定位在扩大的内体中，表明内体形态异常和蛋白质稳态破坏之间存在协同效应。

Rab5^Q79L在体内诱导神经退行性变、神经炎症和TDP-43蛋白病理

GFP-Rab5^Q79L小鼠在3月龄时就表现出脑重量减轻、NeuN阳性神经元减少和皮层变薄等神经退行性变特征。同时，星形胶质细胞标志物GFAP和小胶质细胞标志物Iba1的免疫反应性增强，表明存在神经炎症反应。最重要的是，研究人员在突变小鼠的皮层和丘脑中检测到了磷酸化TDP-43（pTDP-43）包涵体，病理严重程度评分为1级（稀疏）。免疫荧光双标证实这些pTDP-43胞质聚集物仅存在于表达GFP-Rab5^Q79L的细胞中。然而，研究人员未观察到明显的TDP-43核丢失或功能缺失（通过 cryptic splicing 分析评估），也未检测到pTau病理，表明在该时间点，Rab5^Q79L特异性地诱导了pTDP-43病理而非其他共病理。

Rab5^Q79L诱导核膜和核孔复合体形态学改变

鉴于核孔缺陷在TDP-43蛋白病中的报道，研究人员最后检测了核膜完整性。通过Lamin B1和核孔复合体（NPC）的免疫荧光染色，发现GFP-Rab5^Q79L小鼠中存在核膜内陷和NPC分布异常，表明内溶酶体功能障碍也破坏了核膜完整性，可能进一步阻碍TDP-43等蛋白的核质运输。

在讨论部分，研究人员强调了该研究的多个重要意义。首先，这是首个在体内证明内溶酶体功能障碍足以诱发全面神经退行性表型（包括pTDP-43病理）的研究。与过表达野生型Rab5的模型相比，Rab5^Q79L模型表现出更严重的内体扩大（10倍对比2倍）和更早出现的病理表型，为研究内溶酶体系统在疾病早期的作用提供了优越模型。其次，该研究建立了内溶酶体功能障碍与TDP-43病理之间的因果关系，为理解FTD-ALS的发病机制提供了新视角。最后，观察到的核孔复合体异常为内溶酶体系统与核质运输障碍之间的联系提供了新证据，虽然这种异常与TDP-43病理之间的因果关系仍需进一步研究。

研究人员也指出了研究的局限性：使用P0注射可能导致发育缺陷参与表型形成；主要关注脑部而非脊髓病理；pTDP-43病理较为稀疏，在3月龄时未检测到生化水平的pTDP-43积累或明显功能缺失；未能排除在老年小鼠中可能出现tau共病理的可能性。这些局限性为未来研究指明了方向，包括在成年小鼠中使用立体定位注射、延长观察时间点、检测脊髓病理等。

总之，这项研究通过创新的GFP-Rab5^Q79L小鼠模型，有力证明了内溶酶体功能障碍是神经退行性变的关键驱动因素，特别是通过破坏蛋白质稳态而诱导pTDP-43病理。该模型不仅为研究FTD-ALS等疾病的早期机制提供了宝贵工具，也为开发针对内溶酶体系统的治疗策略奠定了坚实基础。