P2-OLD通过tRNA反密码子臂截断机制介导噬菌体P2-Lambda干扰的新发现

为解决噬菌体P2-Lambda干扰机制长期未明的难题，研究人员聚焦于P2-OLD蛋白的功能解析，发现其通过ATP水解激活的Toprim结构域特异性切割宿主tRNAThrUGU的反密码子茎，导致细胞死亡；噬菌体编码的tRNAThrUGU因茎部缩短和CNG基序变异可抵抗切割并挽救毒性。该研究揭示了新型tRNA失活机制，为抗病毒防御提供了新见解。

　　

在噬菌体竞争的长河中，P2-Lambda干扰现象自20世纪50年代发现以来一直是未解之谜。当宿主大肠杆菌携带P2原噬菌体时，Lambda噬菌体的复制会被彻底阻断，这一过程由P2编码的Overcoming Lysogenization Defect (OLD)蛋白主导。尽管早期研究暗示OLD可能通过DNA靶向引发细胞死亡，但其具体机制始终模糊不清，尤其与RecBCD复合物抑制后的毒性激活关联缺乏直接证据。更令人困惑的是，OLD蛋白虽具备Toprim结构域（常见于多核苷酸切割酶），且体外实验显示其可切割DNA，但细胞内DNA损伤从未被证实，且ATP酶或Toprim结构域的活性位点突变虽能消除毒性，却不影响体外DNA切割活性，暗示OLD可能存在未知的细胞毒性机制。

长期以来，研究注意到P2-Lambda干扰早期会出现蛋白质合成 arrest，且与宿主tRNA失活相关，但tRNA失活的具体形式和与OLD的直接联系从未被阐明。这些问题阻碍了对噬菌体防御机制的深入理解，也限制了针对此类系统的应用开发。

为破解这一难题，研究人员在《Nucleic Acids Research》上发表论文，通过构建双质粒遗传系统，在大肠杆菌中模拟了P2-OLD的激活条件：一质粒表达P2 old（阿拉伯糖诱导），另一质粒表达Lambda gam（热诱导以抑制RecBCD）。该系统成功复现了OLD依赖的细胞死亡，且毒性特异性依赖于RecBCD的抑制方式（如Gam或T7 Gp5.9有效，而P22 Abc2无效）。通过生长曲线、显微镜观察和核酸完整性检测，团队发现OLD激活导致 nucleoid（拟核）压缩（翻译抑制的标志），并伴随RNA断裂，但DNA保持完整，从而将焦点转向tRNA切割。

关键技术创新包括：

1. 1.

   噬菌体tRNA文库筛选：合成245种coliphage tRNA序列，构建文库并转化至测试菌株，通过生存筛选鉴定抵抗OLD毒性的tRNA；

2. 2.

   Northern印迹和质谱分析：监测tRNA^Thr_UGU的降解动态，并 mapping切割位点；

3. 3.

   体外生化 assay：纯化P2-OLD蛋白，分析其ATP依赖的切割活性及突变体效应；

4. 4.

   tRNA测序（tRNA-seq）：从细胞样本中高通量鉴定tRNA断裂位点；

5. 5.

   结构域交换和突变构建：通过tRNA嵌合体和点突变验证抗性机制。

   样本来源包括大肠杆菌MG1655株、P2+Lambda双重溶原菌（由Laub实验室馈赠）及商业化tRNA提取物。

研究结果揭示：

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  A two-plasmid genetic system to recapitulate P2-OLD activation：双质粒系统证实OLD毒性需Gam共表达，细胞 viability在30-45分钟内骤降，伴随 nucleoid压缩和RNA断裂，但DNA无损伤。

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  Harnessing phage tRNAs to identify the target of tRNA nucleases：筛选发现 only phage threonyl-tRNAs with UGU anticodon（如tRNA^Thr₆）能部分挽救生长缺陷，其他tRNA无此效应。

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  Phage threonyl-tRNAs partially rescue the growth defects induced by P2-OLD：UGU反密码子为必需，突变（如UAC或CGU）则丧失保护功能，证实其通过恢复ACA密码子解码缓解翻译抑制。

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  ATP hydrolysis activates P2-OLD to sever the anticodon stem of tRNA^Thr_U：纯化OLD在体外特异性切割tRNA^Thr_U，无ATP时仅切割位点1（核苷酸28-29），有ATP时增加位点2（核苷酸40-41），形成交错切口；ATP酶突变（H332A）阻断了位点2切割，表明ATP水解激活双切活性。

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  P2-OLD cleaves multiple E. coli tRNAs but favors tRNA^Thr_U：质谱和tRNA-seq显示多个tRNA（如Arg、Val、Ala）被切割，均含 paired CNG motif in anticodon stem和A37，但tRNA^Thr_U切割最快且最彻底，为其主要靶点。

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  Phage rescue tRNAs^Thr are partially resistant to P2-OLD cleavage：噬菌体tRNA^Thr因 anticodon stem缩短（如U43A）和CNG基序变异（如G30C/C40G）而抵抗切割，在生理K⁺浓度下抗性更显著。

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  P2-OLD's anticodon stem amputation activity evades phage tRNA ligases：双切导致12-nt反密码子环片段物理分离，T4 RNA连接酶无法修复，但可连接单切产物，表明该机制逃逸了噬菌体修复系统。

研究结论颠覆了OLD以DNA为靶点的传统模型，确立了其作为ATP酶耦合的Toprim核糖核酸酶的功能，通过反密码子臂截断使tRNA^Thr_UGU失活，触发翻译抑制和细胞死亡。噬菌体通过tRNA茎部改造进化出抗性，这为理解噬菌体竞争提供了分子基础。该发现拓展了Toprim核酸酶的底物范围（从DNA到RNA），并为抗病毒防御系统（如Gabija、PARIS）的机制研究提供了新范式。未来需探索RecBCD抑制如何激活OLD，以及该机制在微生物战中的广泛意义。