PU.1修复C9ORF72重复扩增在神经类器官中引起的小胶质细胞功能障碍

本研究针对C9ORF72基因六核苷酸重复扩增（HRE）导致的肌萎缩侧索硬化症/额颞叶痴呆（C9-ALS/FTD）中小胶质细胞功能紊乱问题，通过构建包含天然发育小胶质细胞的脑类器官模型，结合转录组学分析和功能实验，发现C9突变小胶质细胞存在吞噬功能、溶酶体通路和免疫应答基因下调，并证实转录因子PU.1（SPI1）调控网络紊乱是核心机制，其过表达可挽救小胶质细胞功能缺陷。该研究为C9-ALS/FTD提供了新型体外人类模型，并揭示了PU.1作为潜在治疗靶点的重要意义。

　　

肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）是一种成人发病的神经退行性疾病，以上下运动神经元丢失和进行性肌肉萎缩为特征。其中，C9ORF72基因的六核苷酸（GGGGCC）重复扩增（Hexanucleotide Repeat Expansion, HRE）是家族性ALS和额颞叶痴呆（Frontotemporal Dementia, FTD）最常见的遗传原因。尽管越来越多的证据表明非神经元细胞（如小胶质细胞）在ALS发病机制中发挥作用，但其具体角色和机制尚不完全清楚。近年来，关于C9-ALS/FTD中小胶质细胞功能的研究存在矛盾结果：有些报道显示小胶质细胞活性降低，有些则显示活性增强，这些差异可能源于实验设置、物种选择以及病理机制的不同。尤其值得注意的是，小胶质细胞在体内发挥功能时依赖于与其他细胞类型（如神经元和星形胶质细胞）在三维环境中的相互作用，而传统的二维培养模型无法完全模拟这种复杂的微环境。因此，开发能够再现体内细胞互作和病理特征的新型模型，对于深入理解C9ORF72突变如何影响小胶质细胞功能至关重要。

为了解决这一问题，研究人员利用诱导多能干细胞（iPSC）技术，构建了源自C9-ALS/FTD患者和健康对照的脑类器官模型。这类器官能够先天发育出小胶质细胞（organoid-derived microglia, oMG），并形成包含神经元、星形胶质细胞等多种细胞类型的三维环境，为研究小胶质细胞在疾病条件下的功能提供了更接近生理状态的平台。通过这一模型，研究团队系统分析了C9突变对小胶质细胞形态、转录组、免疫功能以及吞噬能力的影响，并深入探讨了其潜在机制和干预策略。

研究采用了多项关键技术方法：通过iPSC培养和分化生成脑类器官；利用磁激活细胞分选（MACS）分离类器官中的小胶质细胞；进行RNA测序（RNA-seq）和生物信息学分析（包括差异表达基因、KEGG/GO富集分析和转录因子调控网络分析）；通过活细胞成像技术定量分析小胶质细胞的吞噬功能；采用免疫组化、Western blot和荧光原位杂交（FISH）检测蛋白表达和病理特征；通过多重细胞因子检测技术（Luminex xMAP）分析炎症因子分泌；并利用慢病毒载体介导的基因过表达（PU.1/SPI1）进行功能挽救实验。

C9-ALS/FTD oMGs display morphological changes

研究首先发现，与健康对照相比，C9类器官来源的小胶质细胞（C9-oMGs）形态复杂度显著降低，包括细胞面积、周长、分支数量和连接点减少，表明其更接近阿米巴样形态，提示功能状态可能发生改变。

Changes in phagocytosis, lysosomal, and immune response pathways in C9-ALS/FTD oMGs

转录组分析显示，C9-oMGs中有1468个基因表达发生显著改变，其中吞噬作用、溶酶体通路和免疫应答相关基因（如TREM2、TLR4、LAMP1、CCL2等）普遍下调。进一步分析发现，C9-oMGs中稳态小胶质细胞标志基因和疾病相关小胶质细胞（DAM）特征基因表达均受损，表明其功能状态全面失调。

Reduced cytokine and chemokine release in microglia-containing C9ALS/FTD organoids

在炎症反应方面，C9类器官的基础状态下多种细胞因子和趋化因子（如IL-6、TNFα、CCL2）分泌减少，且LPS刺激后炎症反应能力减弱。这一现象在纯化的小胶质细胞培养中并不明显，提示类器官中其他细胞类型可能影响了小胶质细胞的功能表现。

C9-ALS/FTD oMGs show reduced uptake of synaptic proteins

功能实验表明，C9-oMGs在二维和三维环境中均表现出吞噬能力下降：活细胞成像显示其对细菌颗粒（pHrodo）的吞噬效率降低；类器官切片分析发现其摄取突触后蛋白PSD-95的能力减弱，同时溶酶体标志物LAMP1表达减少，提示溶酶体功能异常。

PU.1 overexpression rescues phagocytosis defects in C9 microglia

机制研究发现，转录因子PU.1（由SPI1基因编码）调控网络是C9-oMGs中最显著下调的转录因子群。通过慢病毒过表达PU.1，可显著挽救C9突变小胶质细胞的吞噬功能缺陷，并上调其下游靶基因（如TREM2）的表达，证实PU.1在调控小胶质细胞功能中的核心作用。

研究结论表明，在模拟疾病微环境的三维类器官模型中，C9ORF72重复扩导致小胶质细胞功能全面受损，包括形态简化、吞噬功能下降、溶酶体通路紊乱和炎症反应减弱。这些变化与PU.1转录调控网络失调密切相关，而PU.1的过表达能够有效逆转部分功能缺陷。该研究不仅揭示了C9-ALS/FTD中小胶质细胞功能障碍的新机制，还提出了PU.1作为潜在治疗靶点的重要性。此外，研究强调了复杂细胞环境对小胶质细胞表型的影响，为未来研究神经退行性疾病提供了更接近生理的实验模型。论文发表于《Brain》，为理解ALS/FTD的发病机制和开发靶向小胶质细胞的治疗策略提供了重要依据。