σ70指状结构在转录起始中的位移具有高度异质性和启动子依赖性

为解决细菌转录起始过程中σ因子指状结构（σ-finger）的构象动态和功能机制尚不明确的问题，研究人员利用新型单分子FRET技术实时监测了σ70指状结构在转录起始及启动子逃逸过程中的运动。研究发现σ-finger的位移发生在启动子逃逸之前，其动力学高度依赖启动子类型和RNA 5'端化学修饰，揭示了其在转录调控中的核心作用，为理解基因表达调控提供了新视角。

　　

在细菌基因表达调控的核心环节中，转录起始过程发挥着决定性作用。细菌RNA聚合酶（RNAP）需要与σ因子结合形成全酶，才能特异性识别并启动基因转录。σ因子中一个高度保守的结构模块——σ指状结构（σ-finger），在转录起始过程中扮演着多重关键角色：它不仅能预组织模板DNA，还参与短RNA的流产起始、起始暂停以及启动子逃逸等过程。然而，关于σ-finger在活转录过程中的构象变化、位移机制及其与不同启动子的关系，长期以来缺乏直接证据。

传统结构生物学研究虽然提供了σ-finger与DNA/RNA相互作用的静态快照，但这些研究大多使用人工支架，缺乏真实启动子上下文，且无法捕捉动态过程。特别是σ-finger是否需要从RNA延伸路径上位移、何时位移以及如何位移等基本问题，仍然存在争议。解决这些问题对于深入理解转录调控机制、开发新型抗菌策略具有重要意义。

为此，研究团队开发了一种新型单分子FRET（smFRET）技术，首次实现了对σ-finger运动的实时监测。他们通过对大肠杆菌σ⁷⁰因子进行特异性双标记（位点366和511），结合交替激光激发（ALEX）技术，在三种特性不同的启动子（lacCONS、pR和rrnBP1）上系统研究了σ-finger在转录起始各个阶段的构象变化。该研究发表于《Nucleic Acids Research》，揭示了σ-finger位移的异质性特征和启动子依赖性规律。

研究主要采用以下关键技术：单分子FRET成像技术用于实时监测σ-finger构象变化；荧光探针标记技术（Cy3B和Alexa647）用于特异性标记σ⁷⁰因子；体外转录实验验证RNAP功能完整性；可及体积计算（AV modelling）预测荧光探针空间分布；隐马尔可夫模型（HMM）分析构象动态转变。

σ-finger在RNAP全酶和启动子复合物中具有动态特性

通过双标记RNAP-σ⁷⁰全酶（DL RNAP-σ⁷⁰）的smFRET分析，发现σ-finger存在多种构象状态。在开放复合物（RP_o）中，σ-finger主要呈现" cleft内"构象（E～0.37和0.59），同时存在少量"位移"构象（E～0.14）。动态分析显示约28%的分子在不同构象间转换，表明σ-finger在天然状态下就具有内在流动性。

σ-finger位移发生在启动子逃逸之前且具有长度依赖性

在lacCONS启动子上，当RNA长度小于8 nt时，σ-finger保持稳定" cleft内"构象；当RNA延伸至11 nt时，出现明显的位移构象（18%）；进一步延伸至14 nt时，位移比例增加至31%。重要的是，启动子逃逸实验证实位移都发生在逃逸之前，支持多步骤逃逸模型。

RNA 5'端化学修饰显著影响位移时机

比较5'-OH（引物依赖）和5'-ppp（引物非依赖）RNA发现，后者在更短的RNA长度（5 nt）就引发位移，且位移动力学更快（t_d,short～1.4 s）。这表明5'端三磷酸基团的体积和负电荷与带负电的σ-finger（含D513、D514、E515、D516酸性残基）之间存在排斥作用，促进了早期位移。

不同启动子采用不同的位移机制

lacCONS启动子遵循"RNA碰撞"机制，位移发生在RNA延伸至10 nt后；而pR和rrnBP1启动子则显示早期位移（分别发生在3 nt和2 nt RNA时），表明存在"DNA缩缩驱动"机制。特别是rrnBP1启动子，仅形成二核苷酸就足以引发稳定位移，说明其RPo预存了有利于位移的构象。

σ-finger位移动力学呈现显著异质性

实时动力学分析发现所有启动子都存在快、慢两种位移路径：lacCONS（～14 s和～190 s）、pR（～17 s和～185 s）、rrnBP1（～3.8 s和～36 s）。这种异质性源于RPo的功能异质性，其中慢位移路径可能对应于转录失活状态的RPo分子。

研究结论表明，σ-finger位移是转录起始过程中的一个关键调控步骤，其时机和机制具有启动子特异性和RNA长度依赖性。这项工作不仅揭示了σ-finger在转录调控中的核心作用，还提出了细菌可能通过调节σ-finger位移时机来适应不同生长环境（如指数期vs稳定期）的模型。

该研究的重要意义在于：首先，建立了研究σ因子构象动态的新方法，为实时监测转录机制提供了技术平台；其次，发现了σ-finger位移的启动子依赖性规律，解释了不同基因的转录效率差异；最后，揭示了RNA 5'端化学修饰对转录调控的影响，为理解细菌在不同生理状态下的基因表达调控提供了新视角。

此外，该研究对真核生物转录机制也有重要启示。考虑到古菌和真核生物RNAP中存在类似σ-finger的结构模块（如TFB锌带、CSB、B reader等），类似的构象调控机制可能普遍存在于各生命域的转录系统中。这些发现不仅深化了对基础生物学过程的理解，也为开发针对转录机制的新型抗菌药物提供了潜在靶点。