基于精氨酸-组氨酸脂肽的新型LNP平台实现核酸药物的组织特异性递送与卓越生物相容性

本研究针对传统脂质纳米颗粒(LNPs)在核酸递送中存在的组织靶向性局限、毒性风险及合成复杂性等问题，开发了一种新型RmHnC-DOPE脂肽LNP平台。通过系统优化精氨酸-组氨酸比例，成功实现了siRNA、mRNA和质粒DNA的高效特异性递送，在体内外实验中展现出优异的基因沉默/表达效率、精确的组织靶向性（肝脏/肺部）和卓越的生物安全性，为基因治疗提供了具有临床转化潜力的新型递送系统。

　　

在生物医学领域，核酸药物包括小干扰RNA(siRNA)、信使RNA(mRNA)和质粒DNA(pDNA)等，正成为治疗各种疾病的新希望。然而，将这些遗传物质有效、安全地递送到特定组织和细胞内部，却面临着巨大挑战。脂质纳米颗粒(LNPs)作为递送载体，虽然在COVID-19 mRNA疫苗中取得了成功，但在实际应用中仍存在诸多局限：传统的可离子化脂质（如SM-102）往往缺乏组织特异性，容易在肝脏聚集，难以靶向其他器官；其合成过程复杂，成本高昂；更令人担忧的是，这些合成脂质在体内降解缓慢，可能引发长期毒性问题，特别是当递送不同类型的核酸时，安全性和有效性差异很大。

为了突破这些技术瓶颈，研究人员在《Bioactive Materials》上报道了一种创新性的解决方案——开发了基于精氨酸-组氨酸脂肽(RmHnC-DOPE)的新型LNP平台。这种设计巧妙地将天然氨基酸的优势与脂质递送系统相结合，利用精氨酸提供正电荷用于核酸结合，组氨酸实现pH响应性的内涵体逃逸，DOPE脂质增强膜融合能力，从而创建了一种全降解、高性能的核酸递送系统。

研究团队采用模块化合成策略，通过AIBN引发的自由基硫醇-烯反应将DOPE-Mal与含有末端半胱氨酸的RmHnC肽段连接，构建了13种不同精氨酸-组氨酸比例的脂肽类似物。随后通过微流控技术将最佳脂肽（R3H7C-DOPE、R4H6C-DOPE和R5H5C-DOPE）与辅助脂质（β-谷甾醇、DOPE和DMPE-PEG2000）组装成LNPs，并系统评估了其理化特性、封装效率及体外内递送性能。研究还综合利用动态光散射(DLS)、冷冻电镜(cryo-TEM)、电位滴定等技术表征纳米颗粒特性；通过流式细胞术、荧光显微镜、qRT-PCR等方法评估体外转染效率；借助小动物活体成像技术分析体内生物分布；并开展全面的毒理学评价包括血液生化、组织切片和炎症因子检测。

2.1. 脂肽合成与表征

研究人员成功合成了13种RmHnC-DOPE脂肽变体，通过系统改变精氨酸与组氨酸的比例（m=1-5，n=1-9），研究了肽序列对LNP性能的影响。合成采用AIBN引发的自由基硫醇-烯反应，将DOPE-Mal的马来酰亚胺基团与RmHnC肽段的巯基连接，反应时间短，效率高。

2.2. RmHnC-DOPE LNPs的理化性质

所有13种RmHnC-DOPE LNP变体均表现出良好的理化特性，流体动力学直径在50-150纳米范围内，多分散指数(PDI)低于0.2，与基准SM-102 LNP（85纳米，PDI=0.15）相当。Zeta电位分析显示中等正电性（+0.3-18毫伏），大多数变体在PBS中显示低Zeta电位值（<+10毫伏），在核酸复合化与减少非特异性相互作用间取得了平衡。稳定性评估显示R3H7C-DOPE、R4H6C-DOPE和R5H5C-DOPE在4°C冷藏储存30天后保持<10%的尺寸变化，表明脂肽基LNPs的结构完整性良好。

冷冻电镜图像证实所有RmHnC-DOPE LNPs均呈现均匀的球形形态，显示siRNA和脂质纳米复合物的电子致密有序相。最佳变体的pH响应行为通过其pKa值得到验证（R3H7C-DOPE：6.59；R4H6C-DOPE：6.65；R5H5C-DOPE：6.08），与内涵体pH梯度（5.5-6.3）相匹配，有利于通过质子海绵功能实现内涵体逃逸。所有RmHnC-DOPE LNPs均表现出高封装效率(EE)，siRNA和pDNA的EE超过90%，显著高于SM-102 LNPs（85.0±3.5%）。

2.3. 体外siRNA和质粒DNA转染

2.3.1. 体外siRNA递送与基因沉默

R3H6C-DOPE、R3H7C-DOPE、R4H6C-DOPE和R5H5C-DOPE LNPs在鼠源Hepa1-6细胞中展示了强大的体外基因沉默效力。定量RT-PCR分析显示，R3H7C-DOPE实现了82.7±15.1%的肝脏PCSK9 mRNA降低，显著优于SM-102 LNPs（46.2%）。细胞毒性评估显示所有RmHnC-DOPE变体在治疗相关siRNA剂量（50皮摩尔/孔）下保持>99%细胞活力，与SM-102 LNPs（99%活力）相比无显著细胞毒性。

2.3.2. 质粒DNA转染效率

在HepG2和A549细胞系中评估RmHnC-DOPE LNPs的体外DNA转染效率，使用eGFP编码质粒(peGFP)。荧光显微镜显示所有RmHnC-DOPE LNPs均产生强烈的eGFP表达，其中R3H7C-DOPE和R4H6C-DOPE LNPs的荧光强度与广泛使用的商业转染试剂Lipofectamine 2000相当或更高，而SM-102 LNPs显示低得多的信号强度。

流式细胞术定量揭示了不同LNP制剂在HepG2细胞中的显著差异：R3H7C-DOPE LNPs产生19.1±0.8% eGFP阳性细胞，适度超过SM-102 LNP（16.7±0.6%），但平均荧光强度(MFI)表现出惊人的11倍增加（2.0±0.2×10⁵ vs. SM-102的1.8±0.3×10⁴），表明每个转染细胞的转基因表达更优。虽然Lipofectamine 2000展示了更高的转染效率（55.4±7.8%），但其MFI（2.6±0.3×10⁵）与R3H7C-DOPE无统计学差异。

2.3.3. mRNA转染效率

评估了RmHnC-DOPE LNPs的mRNA递送能力，使用eGFP mRNA作为模型载荷。在HepG2细胞中，R3H7C-DOPE、R4H6C-DOPE和R5H5C-DOPE LNPs分别实现了21.2%、44.5%和74.8%的转染效率，而SM-102 LNP达到98.7%。在肺上皮A549细胞中，R5H5C-DOPE实现了96.0%的转染效率，接近SM-102 LNP（99.9%）的水平，展示了该平台在肺部应用中的潜力。

2.4. RmHnC-DOPE LNP体外转染机制研究

通过使用Cy5标记的siRNA和通路特异性抑制剂，研究了RmHnC-DOPE LNPs的细胞摄取和细胞内运输机制。共聚焦显微镜显示R3H7C-DOPE和R5H5C-DOPE LNPs在HepG2细胞中强效内化，MFI值超过SM-102 LNPs 1.7-2.3倍。

在4°C进行的能量依赖性内吞研究中，R3H7C-DOPE和R4H6C-DOPE LNPs显示了部分能量依赖性摄取途径，在4°C时MFI减少>40%。相反，R5H5C-DOPE和SM-102 LNPs展示了能量依赖性途径，在4°C时MFI减少>85%。

抑制剂研究进一步揭示了LNPs的进入途径：氯丙嗪(CPZ)抑制研究表明网格蛋白介导的内吞作用在R3H7C-DOPE和R4H6C-DOPE LNPs的细胞摄取中作用可忽略，对R5H5C-DOPE LNPs仅产生<20%的抑制。甲基-β-环糊精(MβCD)抑制研究发现脂筏/小窝途径主导了三种RmHnC-DOPEs的摄取，MβCD导致LNP摄取减少超过50%。

RmHnC-DOPE还表现出部分依赖巨胞饮作用，这是一种批量内吞途径，对细胞外液和纳米颗粒的内化至关重要，可被5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利(EIPA)选择性抑制。R3H7C-DOPE、R4H6C-DOPE和R5H5C-DOPE LNPs的细胞摄取分别减少到37.5%、78.1%和54.1%。

通过Bafilomycin A1预处理验证了pH响应性内涵体逃逸机制，该处理抑制了PCSK9 siRNA介导的基因沉默，分别抑制了51.3%（R3H7C-DOPE）、31.6%（R4H6C-DOPE）和60.1%（R5H5C-DOPE LNPs），与SM-102的适度39.1%减少形成鲜明对比。这种差异强调了组氨酸缓冲能力在RmHnC-DOPE制剂中的关键作用，通过质子海绵效应促进内涵体膜破坏。

2.5. RmHnC-DOPE LNPs的生物分布

在C57BL/6小鼠中通过静脉给药评估了RmHnC-DOPE LNPs的生物分布特征和治疗效果。Cy5标记的siRNA负载的LNPs在静脉注射后2小时表现出不同的器官积累模式。R3H7C-DOPE、R4H6C-DOPE和R5H5C-DOPE LNPs优先在肝脏和肺部积累，肝脏荧光强度分别比SM-102 LNPs高1.26倍、1.04倍和1.23倍。相反，SM-102 LNPs在脾脏和肝脏显示升高信号。

2.6. 体内PCSK9 siRNA转染效果

在C57BL/6小鼠中评估了RmHnC-DOPE LNPs的治疗潜力，通过静脉给予封装PCSK9 siRNA的LNPs。R3H7C-DOPE LNPs在静脉注射后7天诱导肝脏PCSK9 mRNA水平降低82.7±15.1%，显著优于SM-102 LNPs（46.2%）。R4H6C-DOPE和R5H5C-DOPE LNPs显示中等效果，分别抑制PCSK9表达79.1±17.7%和29.7±29.5%，与其降低的体外转染效率和生物分布特征相关。

评估了R3H7C-DOPE LNPs的长期PCSK9基因沉默，在给药后28天。R3H7C-DOPE实现持续85.9±7.3%的PCSK9 mRNA敲低。免疫荧光染色结果显示PCSK9 siRNA R3H7C-DOPE LNPs在给药后28天显著上调肝细胞表面的LDL受体表达。

为了进一步验证R3H7C-DOPE LNPs的器官特异性，评估了多个器官中GAPDH siRNA的敲低。在肝脏中，R3H7C-DOPE和SM-102 LNPs表现出相当的基因沉默效果，GAPDH mRNA水平分别降低55%和54%。在肺部，R3H7C-DOPE和SM-102 LNPs均未产生统计学显著的GAPDH敲低。尽管生物分布研究显示siRNA R3H7C-DOPE LNPs在肺部积累，但观察到的边际基因沉默表明核酸在器官中的积累不一定与治疗效果相关。

2.7. 体内萤火虫荧光素酶pDNA和mRNA递送效率

通过静脉注射给予BALB/c小鼠不同负载萤火虫荧光素酶pDNA或mRNA的LNPs，评估其靶向肝外表达的能力。对于pDNA递送，裸pDNA在肝脏显示最小表达，而pFluc-SM102复合物诱导中度肝脏表达和中度脾脏表达。形成鲜明对比的是，pFluc-R5H5C-DOPE在肺部实现特异性表达，而pFluc-SM102未显示肺部表达。

令人惊讶的是，R5H5C-DOPE LNPs对mRNA也展示了高且特异性的肺部表达。裸mRNA未在任何主要器官中产生可检测的表达信号。相反，萤火虫荧光素酶mRNA-SM102 LNPs保持其特性肝脏趋向性，具有强大的肝脏表达且无肺部表达。

定量分析提供了R5H5C-DOPE对pDNA和mRNA卓越肺部靶向效力的令人信服证据。尽管萤火虫荧光素酶mRNA-SM102展示了异常高的肝脏表达效率，但R5H5C-DOPE对pDNA和mRNA递送均表现出显著更高的肺部表达水平，分别显示7.6倍和20.6倍更高的肺部表达水平。

值得注意的是，R3H7C-DOPE和R4H6C-DOPE也展示了肺部靶向递送能力；然而，与R3H7C-DOPE和R4H6C-DOPE相比，R5H5C-DOPE表现出更优的mRNA和pDNA递送效率。这一发现表明精氨酸与组氨酸残基的精确比例在优化器官靶向效率中起关键作用。这一进展克服了传统LNPs的肝脏趋向性，为肺部DNA或mRNA治疗提供了有前景的新策略。

2.8. 体内siRNA LNPs毒性研究

2.8.1. 28天长期治疗的生物相容性

基于对通过静脉注射给予siRNA LNPs的小鼠的血液生化分析，RmHnC-DOPE LNPs未诱导任何生化参数异常升高，表明肝肾功能保持良好。然而，使用H&E染色的组织病理学检查揭示了两种制剂间细微但显著的差异。虽然RmHnC-DOPE LNPs未在主要器官中诱导显著的形态学损伤，但SM-102 LNPs治疗导致肝组织切片中轻度肝细胞萎缩，提示与长期暴露于SM-102相关的潜在肝毒性效应。

ELISA分析揭示了两种制剂间炎症反应的显著差异。虽然通过静脉注射接受siRNA RmHnC-DOPE LNPs的小鼠与对照组相比未显示IL-1β和IL-6产生的显著增加，但SM-102治疗导致IL-1β水平显著升高，表明持续性炎症激活。这种炎症特征表明SM-102可能诱导慢性免疫刺激，对长期治疗应用构成安全隐患。

2.8.2. C57小鼠体内pDNA递送

通过静脉注射后24小时评估了不同pDNA LNPs的急性毒性特征。R5H5C-DOPE LNP治疗的小鼠无死亡，而SM102 LNP组在24小时内经历近100%死亡，表明严重急性毒性。

血清生化分析显示，SM-102组中肝脏和肾脏功能障碍标志物显著升高，包括肝酶（AST、ALT）升高、肾功能标志物（肌酐、BUN）水平增加以及血清白蛋白改变。这些严重的生化异常在pDNA-R5H5C-DOPE组中不存在，表明pDNA-SM-102放大了免疫介导的毒性 beyond 可接受的治疗阈值。

在脾组织中，pDNA-R5H5C-DOPE、空白对照和裸pDNA组均保持红髓和白髓区域的清晰分界。R5H5C-DOPE组显示脾结构内最小中性粒细胞炎症细胞浸润，而裸pDNA组显示主要在白髓区域的轻度中性粒细胞浸润。空白对照组显示正常白髓结构无异常。所有三组在红髓区域显示最小中性粒细胞浸润。相反，用pDNA-SM102 LNPs治疗的脾脏显示严重的病理改变，如红白髓分界不清和表明广泛细胞死亡的显著"星空"外观。

来自pDNA-SM102治疗小鼠的肾脏组织病理学揭示了器官损伤的额外证据，包括炎症细胞浸润和大量红细胞外渗，与急性肾损伤和血管完整性受损一致。

在BALB/c小鼠中的急性毒性评估揭示了与先前C57BL/6研究中观察到的结果显著不同的结局。所有pDNA LNP治疗组在静脉注射后24小时实现100%存活率，包括先前在C57BL/6小鼠中显示近乎完全致死性的pDNA-SM102 LNP组。pDNA-SM102治疗的BALB/c小鼠显示体重轻度变化并表现出嗜睡迹象，表明该小鼠品系对pDNA诱导的免疫毒性具有更大耐受性。

血清生化分析显示，pDNA-SM-102 LNPs与其他组相比仍诱导肝肾功能标志物的显著改变，证据为TIBL、AST、ALT和BUN水平升高，同时血清白蛋白降低。这些发现表明尽管BALB/c小鼠存活了急性挑战，但SM102仍引起 substantial 肝肾功能障碍，尽管改善了存活结局。

有趣的是，与空白对照相比，所有治疗组的尿酸(UA)水平 consistently 增加，包括那些用R5H5C-DOPE LNPs治疗的组。UA的这种普遍升高可能反映了对外源DNA递送的常见代谢反应，无论采用何种递送系统，可能与cGAS-STING通路激活或细胞应激反应导致的核苷酸代谢紊乱有关。

2.9. 讨论

RmHnC-DOPE LNPs across nucleic acid payloads 的独特性能强调了进一步优化其肽-脂质 hybrid 结构的必要性。体内研究显示R3H7C-DOPE LNPs表现出卓越的肝脏靶向siRNA递送，因为3:7的R:H比例通过阳离子电荷密度优化了siRNA复合化，同时保留了pH响应缓冲能力。具体而言，R3H7C-DOPE展示了 exceptional 肝脏靶向特异性，在肝脏中实现82.7±15.1%的PCSK9 mRNA水平降低，在脾脏和肺等肝外器官中观察到最小 effects。这种肝脏PCSK9敲低活性在给药后维持28天，显著优于SM-102 LNPs，展示了肝脏特异性基因治疗应用的 therapeutic 潜力。

有趣的是，尽管R5H5C-DOPE LNPs在细胞水平展示了优异的siRNA递送效果，但其体内肝脏性能 inferior 于R3H7C-DOPE，突出了精氨酸与组氨酸比例在复杂生理环境中决定组织特异性靶向效率的关键作用。然而，R5H5C-DOPE exhibited 更好的肺部siRNA递送能力。对于更大的遗传载荷如mRNA和质粒DNA，R5H5C-DOPE LNPs展示了 exceptional 效果，在HepG2和A549细胞系中实现>80%的eGFP表达，表明跨多样细胞类型的广谱细胞递送能力。尽管R5H5C-DOPE有效地将mRNA和pDNA递送到广谱细胞类型 in vitro，但其在体内表现出高肺部特异性，具有最小肝脏活性。这种体外广谱递送能力与体内组织选择性之间的差异强调了复杂因素（如蛋白质冠 formation、生物分布动力学和组织特异性摄取机制）对治疗结果的显著影响。

R5H5C-DOPE配方似乎平衡了用于载荷封装的阳离子电荷与组氨酸介导的内涵体逃逸，使得能够跨不同细胞系高效细胞内递送mRNA和pDNA。然而， differential 体内靶向特征，尽管在HepG2和A549细胞中具有相当的细胞摄取效率，表明最佳R:H比例密切依赖于载荷特性、靶组织生理学和多重递送屏障。这种机制进一步被巴菲霉素A1预处理对基因沉默的抑制所支持（P<0.05），该处理 disrupts 内涵体酸化。值得注意的是，R5H5C-DOPE LNPs对mRNA/pDNA递送的肺部靶向能力与减少的肝脏积累相关，表明改变的生物分布模式，这可能由蛋白质冠组成而非被动肝脏过滤介导。这些发现与新兴证据一致，即LNPs的体内命运关键取决于表面化学和脂质化学计量学。

关键的是，RmHnC-DOPE LNPs的卓越安全特征代表了对现有配方的显著进展。虽然pDNA固有地激活cGAS-STING先天免疫通路，导致I型干扰素反应和炎症反应，但R5H5C-DOPE LNPs在急性毒性研究中展示了显著耐受性，具有100%存活率。形成鲜明对比的是，SM-102 LNPs在C57BL/6小鼠中诱导严重的全身免疫毒性，具有近乎完全死亡率。即使在更耐受的BALB/c品系中，SM-102引起显著的生化异常，包括升高的肝酶和肾功能标志物。酯连接脂肽的完全生物降解性减轻了与非天然脂质（如SM-102）相关的长期毒性风险，同时在治疗剂量下维持>99%细胞活力。这解决了基因治疗的一个主要转化障碍，其中持久性脂质积累可能触发免疫激活或器官毒性。

2.9.1. 结论

在这项研究中，我们开发了一个具有组织特异性靶向、载荷多功能性和生物相容性的RmHnC-DOPE LNP平台。这些天然来源的RmHnC-DOPE脂肽表现出独特且互补的性能特征：R3H7C-DOPE实现卓越的肝脏靶向siRNA递送，在7天时达到82.7%的PCSK9 mRNA沉默，并在28天时保持85.9%的效果，显著优于SM-102 LNPs（7天时46.2%）。相反，R5H5C-DOPE在体外展示广谱细胞递送，在体内对mRNA/pDNA具有非凡的肺部特异性靶向，成功打破了LNPs的传统肝脏限制。

冷冻电镜验证揭示了在脂肽核心内紧密 condensed 核酸的良好组织 domains，而机制研究确认了多种细胞进入途径，包括小窝蛋白介导的内吞作用和巨胞饮作用，随后是组氨酸介导的内涵体逃逸。

虽然这些RmHnC-DOPE脂肽系统展示了 promising 潜力，但应承认某些局限性。它们的体外mRNA转染效率仍然低于SM-102 LNPs achieved 的水平，表明 further 配方优化的机会。此外，使用pDNA递送的急性毒性研究 revealed that RmHnC-DOPE LNPs，虽然保持100%存活率，但确实由于pDNA触发的固有cGAS-STING通路激活而引起某种程度的炎症反应。

尽管存在这些限制，该平台通过协调天然化学与治疗多功能性和增强的安全特征，建立了可离子化脂质工程的新范式。互补的R3H7C-DOPE和R5H5C-DOPE系统使得应用范围从可持续肝脏靶向基因沉默到前所未有的肝外肺递送，解决了核酸基治疗中的主要治疗空白，并对治疗肝脏和肺部疾病具有变革性潜力，在这些领域中靶向、无毒性递送一直具有挑战性。