硫酸化壳聚糖（SCS）通过骨骼干细胞年轻化增强BMP-2介导的老年脊柱融合

本研究针对老年脊柱融合手术中因衰老微环境及干细胞功能衰退导致的融合失败问题，开发了一种BMP-2/SCS/CPC复合支架。研究发现，SCS能协同BMP-2显著提升老年小鼠脊柱融合成功率（83.3%），促进新骨形成及H型血管发育，并通过抑制破骨细胞过度活化、降低MMP-9分泌，实现椎体骨骼干细胞（vSSC）年轻化。该策略为改善老年患者脊柱融合效果提供了新思路。

　　

随着人口老龄化加剧，脊柱退行性疾病的发病率显著上升，脊柱融合术成为治疗此类疾病的关键手段。然而，老年患者面临严峻挑战：衰老的局部微环境、干细胞功能减退或耗竭，以及炎症水平升高，导致术后融合失败率居高不下，甚至可达48%。尤其在多节段融合术中，骨愈合难度更大，风险更高。传统方法如自体髂骨移植虽被视为“金标准”，却伴随诸多并发症，包括血管神经损伤、关节破坏、骨折等，且取材量有限。为克服这些局限，骨诱导生长因子如骨形态发生蛋白-2（BMP-2）被广泛应用，它具强效成骨诱导性，在临床试验中展现出 promising 的结果。但BMP-2临床应用存在明显短板：半衰期极短（仅6.7分钟），需使用超生理剂量来维持疗效，而高剂量又会引发软组织炎症、异位骨化、骨囊肿形成等副作用。在衰老个体中，低剂量效果不足，高剂量则风险加剧，形成两难局面。此外，衰老微环境中的干细胞活性降低、数量减少及分化倾向改变，进一步削弱了BMP-2等生长因子的治疗潜力。

针对这些挑战，研究人员将目光投向细胞外基质中的肝素，它可通过与BMP-2的肝素结合域特异性结合，增强其成骨活性。但肝素本身存在结构变异、抗凝血特性，长期使用可能导致骨吸收和骨质疏松风险增加。为此，本研究团队前期开发了硫酸化壳聚糖（SCS），一种类肝素多糖，它保留了对BMP-2的高亲和力，却无肝素的抗凝血效应。SCS还被证明可促进BMP受体表达，增强BMP-2介导的成骨作用，并在体内模型中显示出抗炎效果。基于这些发现，本研究提出将SCS与BMP-2共同负载于钙磷骨水泥（CPC）支架上，以协同增强BMP-2的成骨潜力，特别是在骨质疏松和衰老个体中改善脊柱融合 outcomes。

本研究发表于《Bioactive Materials》，旨在探索BMP-2/SCS/CPC复合支架在老年脊柱融合中的应用效果及机制。研究人员通过扫描电镜（SEM）表征材料形态，酶联免疫吸附测定（ELISA）分析细胞因子水平， micro-CT 进行骨微结构及血管三维重建，组织学染色（如H&E、Masson、TRAP）评估骨形态和细胞活动，免疫荧光染色观察特定蛋白表达，流式细胞术分选并分析骨骼干细胞（vSSC）群体及其分化，并利用体外细胞培养模型验证支架提取物对破骨细胞和vSSC分化的影响。

研究首先评估了衰老微环境对BMP-2/CPC支架脊柱融合效率的影响。通过将BMP-2（10 μg）和CPC（20 mg）植入年轻（6-8周）和老年（18个月）小鼠L4/L5横突区间， micro-CT 分析显示，老年小鼠融合成功率仅16.7%，远低于年轻组的83.3%。老年组骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和数量（Tb.N）显著降低，分离度（Tb.Sp）增加，表明衰老微环境严重损害了BMP-2/CPC的融合效果。

为克服这一局限，研究设计了五组实验：CPC对照组、BMP-2（10 μg）组、高剂量BMP-2（hBMP-2, 25 μg）组、BMP-2/SCS（10 μg BMP-2 + 20 μg SCS）组及hBMP-2/BP（25 μg BMP-2 + 20 μg 阿仑膦酸钠）组。SEM证实支架成功负载各组分，BMP-2释放曲线显示SCS加入降低了初始突释（从70%至25%），实现更缓释 profile。8周后 micro-CT 显示，BMP-2/SCS组融合成功率最高（83.3%），而hBMP-2组为50%，BMP-2组仅16.7%，hBMP-2/BP组则完全抵消BMP-2的促进效应。BMP-2/SCS组表现出丰富、有序的骨小梁结构，骨整合良好。组织学染色（H&E、Masson）进一步证实BMP-2/SCS组融合最佳，纤维结缔组织最少，新骨与旧骨无缝整合。钙黄绿素双标显示BMP-2/SCS组矿化沉积率（MAR）和骨形成率（BFR/BS）显著提升，免疫荧光及ELISA检测到更高骨钙素（OCN）和I型前胶原N端前肽（PINP）水平，表明成骨活性增强。

研究进一步探讨了BMP-2/SCS对血管化的影响。CT血管造影及免疫荧光（lectin、CD31/Emcn）显示，BMP-2/SCS组血管化最 robust，H型血管（CD31⁺Emcn⁺）在早期（3天）即形成，7天达峰值，14天仍维持较高水平，远高于其他组。Osterix⁺骨祖细胞数量在BMP-2/SCS组也更高，表明H型血管有效招募 osteoprogenitor 细胞，支持骨形成。

破骨细胞活性分析显示，TRAP染色及CTX-I检测表明BMP-2组破骨细胞数量及骨吸收活性较高，hBMP-2组更甚，而BMP-2/SCS组破骨细胞数量适中，活性平衡。体外实验证实BMP-2支架提取物促进破骨细胞分化及骨吸收陷窝形成，而BMP-2/SCS提取物抑制此过程，并下调破骨细胞相关基因（Nfatc1、c-Src、Trap、Ctsk）表达。

通过流式细胞术分析vSSC（CD45^?TER119^?CD51⁺Tie2^?6C3^?Thy1^?CD105^?）发现，BMP-2/SCS组在7天时vSSC比例最高，且 stromal 谱系分化（CD51⁺Tie2^?6C3⁺Thy1^? 和 CD51⁺Tie2^?6C3^?Thy1⁺）最低，而骨/软骨谱系分化得以维持。hBMP-2/BP组则完全抑制vSSC招募及年轻化。体外成骨诱导实验（ALP、茜素红S染色）显示BMP-2/SCS未进一步促进vSSC成骨分化，表明其作用主要通过抑制 stromal 偏向实现。

衰老微环境分析显示，BMP-2/SCS组衰老细胞（p16⁺）、衰老髓系细胞（p16⁺CD45⁺）及衰老巨噬细胞（p16⁺F4/80⁺）比例最低。ELISA检测 SASP 因子发现BMP-2组促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）升高，而BMP-2/SCS组这些因子水平降低，抗炎因子（IL-10、IL-4）及 TGF-β1 水平升高，表明微环境向抗炎、促再生转变。

机制上，研究聚焦破骨细胞分泌因子，发现BMP-2/SCS组 MMP-9 和 MMP-14 水平变化显著。通过加入中和抗体，证实 MMP-9 抗体可消除BMP-2/SCS的 vSSC 年轻化效应，而 MMP-14 抗体无此作用。免疫荧光显示 MMP-9 与 TRAP⁺ 破骨细胞共定位，体外浓度梯度实验表明低于100 ng/mL的 MMP-9 具抗衰老作用，50 ng/mL时最优。

本研究结论表明，BMP-2/SCS/CPC支架通过调节破骨细胞活性，促进 MMP-9 分泌，重塑细胞外基质，逆转 vSSC 衰老，抑制 stromal 谱系分化，增强骨/软骨分化，从而 rejuvenate 衰老微环境，提升血管化及成骨能力，最终显著改善老年脊柱融合效果。讨论部分强调，该策略不仅证实了 osteoclast-vSSC 轴在骨再生中的核心作用，还为 BMP-2 的临床应用提供了新思路，即通过协同材料（如SCS）平衡其成骨与炎症效应，避免高剂量副作用。同时，研究揭示了 MMP-9 在干细胞年轻化中的特异性功能，为靶向衰老相关疾病提供了新靶点。然而，分子通路细节、跨物种差异及长期效应仍需进一步探索。总体而言，该工作为开发老年骨再生策略提供了重要理论和实验依据。