第四届生物制品中外源病毒检测新一代测序技术会议报告：NGS验证与实施推动病毒安全检测革新

本报告总结了第四届NGS检测生物制品外源病毒会议的核心内容，重点探讨了如何通过验证与实施新一代测序技术（NGS）替代传统的体内（in vivo）和体外（in vitro）病毒检测方法。研究人员系统评估了NGS在灵敏度（LOD）、特异性及检测广度方面的性能，并分享了WHO国际参考品、参考病毒数据库（RVDB）等关键资源的最新进展。研究结果表明，NGS已具备替代动物实验和部分细胞培养检测的能力，并可显著提升对未知病毒的检出能力。该技术不仅符合减少动物使用的“3R”原则，也为基因治疗、疫苗和生物制剂的安全性提供了更高效、全面的解决方案，对全球生物制品监管和病毒安全策略具有重要指导意义。

　　

在生物制药领域，病毒安全性一直是产品质量和患者安全的核心问题。传统的病毒检测方法，如动物实验（in vivo）和细胞培养法（in vitro），不仅耗时长、灵敏度有限，还无法有效检测未知或罕见病毒。随着新一代测序技术（NGS）的快速发展，科学家和监管机构开始探索其在外源病毒（AV）检测中的应用潜力。2010年，猪圆环病毒1型（PCV1）在已上市轮状病毒疫苗中的意外发现，进一步凸显了现有检测方法的局限性，并加速了NGS技术的引入进程。

为系统评估NGS技术的验证和实施路径，国际生物标准化联盟（IABS）于2024年12月4日至5日在德国法兰克福召开了第四届“NGS用于人和动物生物制品外源病毒检测”会议。会议由美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品质量与健康管理局（EDQM）共同主持，汇聚了来自学术界、工业界、合同研究组织（CRO）及全球监管机构的专家，旨在推动NGS技术的标准化和广泛应用。

本研究主要依托会议报告和讨论内容，未涉及新的实验数据，但全面回顾和评估了NGS技术在外源病毒检测中的最新进展。关键方法包括：使用WHO国际参考病毒面板（包括EBV、FeLV、RSV、REO、PCV1等7种病毒）进行灵敏度（LOD）和特异性验证；利用参考病毒数据库（RVDB）进行生物信息学分析；采用短读长（如Illumina）和长读长（如Oxford Nanopore）测序技术进行比较研究；并通过多中心协作研究（如AVDTWG的病毒加标研究）评估不同基质（如细胞系、病毒种子、收获液）中的检测性能。

一、NGS技术验证与性能评估

研究人员通过病毒加标研究验证了NGS技术的灵敏度和特异性。结果表明，NGS能够稳定检测到每毫升10^3至10^4病毒基因组拷贝（VGC）的污染病毒，部分病毒（如PCV1和EBV）的检测限甚至低至10^1 VGC/mL。与传统的PCR方法相比，NGS在灵敏度上表现相当，但检测范围更广，能够同时覆盖已知和未知病毒。

二、监管指南与标准进展

会议重点讨论了ICH Q5A(R2)指南和欧洲药典（Ph. Eur.）新章节2.6.41的内容。这些文件明确鼓励使用NGS替代体内实验和部分体外检测，并提供了详细的验证原则和方法要求。WHO的第一批NGS国际参考面板的发布，为全球实验室的验证工作提供了重要标准。

三、生物信息学与数据分析

参考病毒数据库（RVDB）的持续优化和更新，显著提高了病毒检测的准确性和效率。新版RVDB（v29.0）通过去除冗余序列（如SARS-CoV-2的多余记录）和注释非病毒区域，减少了假阳性结果。此外，机器学习（ML）和人工智能（AI）模型（如VirHunter）被用于预测和识别新型病毒，进一步提升了数据分析能力。

四、应用案例与实施经验

多家企业（如阿斯利康、赛诺菲）分享了NGS在疫苗和基因治疗产品中的实际应用案例。例如，阿斯利康使用NGS替代了流感疫苗的体内检测，将检测周期从60天缩短至32天，并实现了零无效实验。赛诺菲则通过建立自动化生物信息学流程（PhyloID），显著提高了数据分析和决策效率。

五、技术挑战与未来方向

尽管NGS技术取得了显著进展，但仍面临一些挑战，如复杂基质（如昆虫细胞收获液）中的检测灵敏度问题、长读长测序技术的错误率较高，以及缺乏适用于转录组学分析的参考标准。未来工作需要进一步优化样本前处理流程、开发更高效的生物信息学工具，并推动全球范围的标准化和培训。

本研究通过系统评估NGS技术在外源病毒检测中的验证和实施路径，证实了其替代传统方法的可行性和优势。NGS不仅能够提供更全面、灵敏的病毒检测方案，还能显著减少动物使用，符合全球监管的“3R”原则。随着ICH、WHO和Ph. Eur.等相关指南的不断完善，NGS技术有望在生物制品的病毒安全检测中发挥越来越重要的作用，为产品质量和公共健康安全提供更加可靠的保障。