靶向MYC G-四链体的苯并噻唑衍生物BTO-28的分子识别机制与转录调控作用研究

本研究针对MYC癌基因启动子区G-四链体（G4）的靶向调控难题，设计合成苯并噻唑衍生物BTO-28，通过NMR解析其与MYC G4的2:1复合物结构，首次揭示配体作为碱基替代物与 flanking 区域形成独特氢键模式的分子机制。BTO-28通过稳定G4结构抑制SP1结合和RNAPII募集，显著下调MYC转录，为G4靶向抗癌药物开发提供新策略。

　　

在癌症研究领域，MYC癌基因因其在超过半数人类肿瘤中异常高表达而成为极具吸引力的治疗靶点。然而，由于MYC蛋白本身缺乏经典药物结合口袋，直接靶向抑制其功能面临巨大挑战。近年来，科学家们另辟蹊径，将目光投向调控MYC转录的非典型DNA二级结构——G-四链体（G-quadruplex, G4）。这些由鸟嘌呤富集序列形成的四链体结构，尤其在MYC启动子区的NHE III₁区域，能够通过阻碍转录因子结合和RNA聚合酶进程来抑制基因表达。尽管小分子稳定G4结构已成为一种潜在的治疗策略，但如何实现高亲和力、高选择性的靶向，以及阐明配体与G4相互作用的分子机制，仍是该领域亟待解决的核心问题。

针对这一挑战，中国科学院上海有机化学研究所曹春阳团队与香港理工大学黄永良团队合作，在《Nucleic Acids Research》发表了题为"Molecular recognition and effects of a benzothiazole derivative targeting the MYC G-quadruplex"的研究论文。该研究通过多学科交叉方法，系统阐明了苯并噻唑衍生物BTO-28与MYC G4的特异性识别机制及其转录调控功能。

研究人员主要采用核磁共振（NMR）技术解析复合物结构，结合质谱分析、圆二色谱、荧光偏振、差示扫描量热、DNA聚合酶终止实验、细胞活力检测、定量PCR、染色质免疫沉淀和双荧光素酶报告基因等关键技术方法。其中NMR结构解析在10 mM K⁺条件下进行，使用800 MHz谱仪采集二维NOESY、TOCSY等数据；细胞实验采用HT-29结直肠癌细胞系和HK-2正常肾细胞；启动子活性分析通过构建野生型及突变型MYC启动子荧光素酶报告系统实现。

BTO-28以高亲和力结合MYC G4

通过¹H NMR滴定实验发现，BTO-28与MYC G4的结合属于慢交换过程，表明两者间存在高强度相互作用。质谱分析明确显示复合物形成2:1的化学计量比。荧光偏振实验测得BTO-28与MYC G4的解离常数K_D低至6.8 nM，显著优于其他G4结构及双链DNA，展现出优异的选择性。圆二色谱证实结合后MYC G4的平行拓扑构象得以保持。

配体结合显著稳定G4结构

差示扫描量热结果表明，BTO-28使MYC G4的熔解温度提升25.6°C，而对双链DNA则产生 destabilizing 效应。DNA聚合酶终止实验进一步验证，BTO-28浓度依赖性地阻滞聚合酶延伸，证明其能够促进G4结构的形成与稳定。

2:1苯并噻唑-MYC G4复合物的全面质子分配

通过¹⁵N标记鸟嘌呤的HSQC实验及二维NOESY谱图，研究人员完成了复合物中所有非交换质子的全 assignment。关键intermolecular NOE信号的发现，为解析配体与DNA间的空间取向提供了直接证据。在低离子强度（10 mM K⁺）条件下，复合物呈现出更尖锐的谱峰，表明结合后构象动态性降低。

NMR结构揭示独特结合模式

基于NOE约束的分子动力学计算获得了高分辨率复合物结构（PDB: 9L4E）。结构显示BTO-28并非简单堆叠于G-四分体外部，而是作为碱基替代物嵌入5'和3'末端：其苯并噻唑环与quinoline单元分别与G8/G13和G6/G10发生π-π堆叠，而pyrrolidine侧链则深入groove区域，与G8N3形成氢键（距离约2.6 ?）。尤为重要的是，苯并噻唑硫原子与 flanking 碱基A3和A21的氨基形成氢键及chalcogen键，这种recruitment机制此前未见报道。

BTO-28调控MYC转录

细胞实验表明BTO-28可抑制HT-29癌细胞增殖（IC₅₀≈273 nM），而对正常HK-2细胞无明显毒性。qPCR检测显示BTO-28特异性下调MYC mRNA表达，且ChIP实验证实其减少转录因子SP1和RNAPII在MYC启动子的富集。双荧光素酶报告系统证明，BTO-28对启动子活性的抑制依赖于G4结构的存在，当核心鸟嘌呤被突变后，抑制作用完全消失。

本研究通过结构生物学与功能研究相结合，首次揭示了苯并噻唑类配体作为碱基替代物与MYC G4 flanking 区域形成特异性氢键网络的分子机制。BTO-28通过双重作用模式——末端G-tetrad堆叠与groove区域氢键相互作用——实现纳摩尔级亲和力与结构稳定性提升。该工作不仅为G4靶向药物设计提供了新范式（如利用chalcogen键增强识别特异性），也验证了通过稳定启动子G4结构调控MYC转录的可行性。尽管基因组广泛存在的G4 motif可能带来 off-target 风险，但本研究揭示的末端特异性结合机制为开发高选择性配体指明了方向。未来结合ATENA等精准靶向技术，有望实现MYC G4的特异性干预，为癌症治疗提供新策略。