PIM1癌基因G-四链体-双链体杂合结构识别机制：双喹啉类配体Phen-DC3与360A的结合模式与细胞环境下的构象调控研究

为解决G-四链体-双链体杂合结构（QDH）靶向选择性不足的问题，研究人员开展了双喹啉类配体Phen-DC3与360A结合PIM1癌基因启动子区QDH的结构机制研究。通过高分辨率NMR与分子动力学模拟，揭示了配体在Q-D连接处的特异性结合模式及动态差异，并利用19F细胞内NMR技术证实了配体在生理环境下仍能选择性稳定杂交型QDH构象。该研究为设计高选择性QDH靶向药物提供了原子水平的结构基础。

　　

在人类基因组中，富含鸟嘌呤的序列能够形成非典型的核酸二级结构——G-四链体（G-quadruplex, G4），这类结构广泛存在于端粒、着丝粒以及多种癌基因的启动子区域，参与调控DNA复制、转录和损伤修复等关键生物学过程。尤其值得注意的是，当G4结构与相邻的双链DNA通过特定 loop 连接形成G-四链体-双链体杂合结构（quadruplex-duplex hybrids, QDH）时，其结构复杂性和功能特异性更为突出，成为抗癌药物开发的新靶点。然而，由于QDH具有多态性，且在不同环境（如体外与细胞内）下可能呈现不同优势构象，开发能够高选择性识别特定QDH拓扑结构的配体仍面临巨大挑战。

以往的研究中，双喹啉类衍生物Phen-DC3被证明对G4结构具有高亲和力和一定的选择性，尤其倾向于结合QDH中的四链体-双链体连接界面（Q-D junction），但其在不同QDH构象之间的结合特异性及机制尚不明确。此外，另一个类似物360A虽然结构相近，但其结合特性与动态行为仍未被系统阐释。为了解决上述问题，由Anirban Ghosh、Jakub Harnos、Petr Stadlbauer、Ji?í ?poner、Martina Lenar?i? ?ivkovic和Lukas Trantirek共同完成的一项研究，综合运用多种结构生物学和计算模拟方法，深入揭示了Phen-DC3与360A与来源于PIM1癌基因启动子的QDH的相互作用机制，并首次在细胞真实环境中验证了它们的构象选择性与结合行为。该成果发表于《Nucleic Acids Research》，为理性设计靶向QDH的创新药物提供了重要理论依据和技术支撑。

在研究过程中，作者主要采用了以下几项关键技术方法：圆二色谱（CD）用于分析DNA构象和热稳定性变化；高分辨率核磁共振（NMR）波谱（包括¹H、¹³C、¹⁵N及¹⁹F检测）用于解析溶液结构及配体-DNA相互作用；分子动力学（MD）与增强采样元动力学模拟（well-tempered metadynamics）用于研究结合动态与能量景观；以及以非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞为模型的细胞内¹⁹F NMR技术，用于在近生理环境下验证靶点构象与配体结合行为。

Phen-DC3与360A选择性结合源自PIM1基因启动子的杂交拓扑结构QDH

通过比较三种PIM1来源的序列——SO7（稳定形成杂交型QDH）、SO2（反平行型QDH）以及多态性SO8（同时存在两种构象），研究团队利用NMR和CD分析发现，两种配体均能以1:1化计量比特异性结合杂交型QDH（SO7及SO8中的杂交形态），而对反平行型（SO2）几乎不结合。CD熔解实验显示，Phen-DC3和360A分别使SO7的熔解温度（T_m）提高13.5°C和8.6°C，但对SO2的稳定性影响甚微。竞争性NMR实验进一步确认，在SO7与SO2混合体系中，配体仅与杂交型QDH结合，表明其具有高度的构象选择性。

分子间NOE接触将配体定位于Q-D连接处

通过二维NOESY谱图，研究者共指认了73个（Phen-DC3复合物）和40个（360A复合物）分子间NOE相关信号，这些信号主要分布于配体与G5·G9·G20·G27四重体以及G19-C10碱基对之间，证实两者的结合位点均位于Q-D界面。其中，Phen-DC3以其较大的菲啰啉环插入四重体与双链之间，形成刚性结合模式；而360A因吡啶环较小，呈现动态重取向行为，这一差异通过EASY-ROESY中的交换相关峰得以验证。

SO7-Phen-DC3与SO7-360A 1:1复合物的三维高分辨率结构

基于NMR约束数据计算得到的结构表明，配体结合并未改变SO7的整体折叠拓扑。Phen-DC3以菲啰啉环插入Q-D连接处，两个喹啉环分别朝向中等沟和窄沟；360A则一个喹啉环插入界面，吡啶环朝向G27，另一喹啉环暴露于溶剂。结构比较显示，配体结合引起窄沟宽度增加（分别增加3.3 ?和4.4 ?），并扰动茎环末端的空间排布，包括A16与G17-C12碱基对的堆叠作用增强。

分子动力学模拟揭示360A在结合口袋内可占据两个不同位置

通过常规与增强采样分子动力学模拟，研究发现Phen-DC3在结合口袋中取向稳定，主要运动为水平滑动（~2 ?）和轴向旋转；而360A存在两个能量最低的取向状态，且可在两者之间转换。这一结果与NMR中观察到的360A动态行为一致，说明其较小的中心环及较弱的堆叠作用导致结合模式的不稳定性。

Q-D连接处突变对配体结合的影响

通过设计一系列SO7突变体（如茎环长度缩短、碱基对替换或缺失），作者证明至少一个Watson-Crick碱基对与G4单元共轴堆叠是维持配体特异性结合的关键。例如，当G19-C10被替换为T-T错配时，配体结合转为非特异性，且可能诱发多种Hoogsteen氢键复合物的形成。

细胞内环境对PIM1 QDH构象及配体结合的影响

利用¹⁹F标记的SO8-F序列及非洲爪蟾卵母细胞内NMR技术，研究者发现，在细胞内环境中，SO8-F主要采用反平行构象（比例约1:5），与体外条件下（杂交型占优）显著不同。然而，当引入Phen-DC3或360A后，杂交型QDH-配体复合物成为主导，表明配体在复杂细胞内环境中仍能选择性识别并稳定杂交型QDH。细胞活性实验证明卵母细胞在微注射及NMR检测过程中保持完整，排除了降解或泄漏对信号的干扰。

讨论与结论

该研究系统阐释了双喹啉类配体Phen-DC3与360A在原子分辨率上结合PIM1 QDH的机制差异，突出其对于杂交型拓扑的特异性识别能力。与以往报道不同，本研究中配体并未引起反平行QDH向杂交型的重构，这一差异可能源于PIM1 QDH中5'-GC悬垂及界面结构的独特性。细胞内实验进一步表明，尽管细胞环境更利于反平行构象，配体仍可逆转向杂交型优势的复合物状态，彰显了其在实际生物体系中的应用潜力。

该工作不仅为QDH靶向药物的合理设计提供了关键结构见解，还展示了¹⁹F细胞内NMR在药物筛选与结构生物学中的强大能力。通过整合高分辨率结构分析、动态模拟与细胞环境验证，本研究建立了一个从原子到细胞水平研究核酸-配体相互作用的范式，对未来开发具有更高选择性的G4/QDH靶向疗法以及核酸纳米技术器件具有重要指导意义。