艰难梭菌中两个共调控反应调节因子CmrR与CmrT的相互作用机制及其在转录调控中的功能解析

本刊推荐：本研究深入解析了艰难梭菌（Clostridioides difficile）非典型双组分系统CmrRST中两个OmpR家族反应调节因子CmrR与CmrT的相互作用机制。通过细菌双杂交（BACTH）、Pull-down实验和电泳迁移率变动分析（EMSA）等技术，揭示了二者的同源/异源二聚化特性及DNA结合特异性。研究不仅鉴定了CmrR的自调控结合序列（ACAATNNNNNNNNATTGT），还发现其可能调控多个基因组位点，为理解细菌环境适应机制及感染性腹泻的病原生物学提供了重要分子基础。

　　

引言

艰难梭菌（Clostridioides difficile）是一种严格厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，作为医院获得性感染性腹泻的主要病原体，每年仅在美国就导致约50万例感染和3万例死亡。其生存依赖于宿主肠道环境，因此必须通过信号转导系统感知并响应复杂多变的肠道微环境。双组分系统（Two-Component System, TCS）是细菌响应环境变化的核心机制之一。在流行菌株R20291中编码了40余个TCS，其中cmrRST操纵子编码了一个非典型TCS，包含一个组氨酸激酶CmrS和两个反应调节因子CmrR与CmrT。此前研究发现，这一系统调控多种重要表型，包括菌落形态、细胞链状排列、运动性和生物膜形成等。

CmrR与CmrT的蛋白结构特征

CmrR具有典型的接收结构域（receiver domain），包含保守的磷酸化位点D52、DD motif（D8、D9）、T/S（S78）和K（K101）等关键残基，其三级结构由5个α螺旋环绕5个β折叠片构成。磷酸化可稳定其活性构象，促进α4-β5-α5二聚化界面的形成。而CmrT的接收结构域属于无天冬氨酸接收器（Aspartate-less Receiver, ALR）亚类，其磷酸化位点由谷氨酸（E53）替代，且DD motif变为DGD（D9、G10、D11）。结构分析表明，CmrT的活性位点残基（D9、E53、T80、K102）通过氢键网络自发形成类磷酸化活性构象，推测其具有组成型活性。

同源二聚化与异源二聚化的实验验证

通过大肠杆菌（Escherichia coli）和艰难梭菌的细菌双杂交系统（BACTH）及Pull-down实验，本研究系统评估了CmrR与CmrT的二聚化能力。结果显示，CmrT在两种杂交系统中均形成强同源二聚体，而CmrR的同源二聚仅通过Pull-down实验检测到，推测其可能依赖CmrS的磷酸化激活。此外，Pull-down实验证实CmrR与CmrT可形成异源二聚体，且该相互作用具有特异性（与同家族蛋白CDR20291_2188无互作）。这一发现提示CmrR与CmrT可能通过异源二聚化拓展其调控复杂性。

CmrR的磷酸化模拟突变与功能分析

为模拟CmrR的磷酸化状态，研究者构建了D52E突变体。表型实验显示，CmrR-D52E在艰难梭菌中诱导更强的表面运动性，但其在双杂交系统中未增强二聚化信号，可能与荧光蛋白标签干扰有关。另一方面，针对CheY中已知激活位点K+2对应的Y103A突变并未增强CmrR活性，说明其调控机制可能存在家族特异性。

CmrT活性位点突变体的功能缺陷

通过丙氨酸扫描突变（D9A、E53A、T80A、K102A及四突变体DETK），本研究评估了CmrT活性位点残基的功能重要性。表型实验表明，D9A和K102A单突变显著削弱表面运动性（分别降低31%和23%）及二聚化能力，而E53A和T80A影响较小。四突变体DETK表型缺陷最严重（运动性降低43%），证明CmrT的组成型活性依赖多个残基的协同作用，而非单一残基主导。

CmrR的DNA结合特性与调控网络

通过电泳迁移率变动分析（EMSA）和碱性磷酸酶（AP）报告系统，本研究鉴定出CmrR在cmrRST操纵子上游TSS4转录起始位点前62 bp区域内结合一个反向重复序列（ACAATNNNNNNNNATTGT）。启动子突变实验证实，该序列的右侧反向重复（ATTGT）是CmrR识别的关键位点。进一步通过生物信息学搜索，在基因组中鉴定出12个同源序列，位于多个基因启动子区（如精氨酸代谢调控基因rocR、TCS基因CDR20291_0446、核糖体蛋白基因rpmH等）。EMSA验证其中5个位点可与CmrR结合，提示CmrR可能直接调控多个生理过程。

讨论与模型构建

本研究提出CmrRST系统的多层次调控模型：在无信号刺激时，CmrT以组成型活性同源二聚体形式调控其靶基因；当CmrS感知信号并磷酸化CmrR后，后者形成同源二聚体激活cmrRST转录，同时可能与CmrT形成异源二聚体调控第三类基因。这种调控模式与链霉菌中的BldM/WhiI异源二聚化系统类似，但独特之处在于cmrR与cmrT的共转录特性及CmrR对自身操纵子的正向反馈。此外，CmrRST的表达还受c-di-GMP核糖开关和可逆倒位元件的多层次调控，进一步增强了其环境响应灵活性。

研究意义与展望

本研究揭示了非典型TCS的复杂调控机制，为理解细菌信号转导网络的进化与适应性提供了新视角。对CmrR和CmrT二聚化及DNA结合特性的解析，不仅深化了对艰难梭菌致病机制的认识，也为针对TCS的抗菌药物开发提供了潜在靶点。未来研究需进一步明确CmrS的信号分子、CmrT的DNA结合序列及异源二聚体的具体生物学功能。