碳水化合物与磷酸戊糖途径氧化支路通过相变S层蛋白调控Bacteroides thetaiotaomicron的噬菌体抗性机制研究

本研究发现人类肠道共生菌Bacteroides thetaiotaomicron通过相变S层蛋白（BT1927）介导的噬菌体抗性受到碳水化合物代谢的精细调控。研究揭示N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）和黏蛋白O-糖链通过增加外膜囊泡（OMV）释放和减少S层表面展示，显著增强多种噬菌体（如ARB25）的感染敏感性，而磷酸戊糖途径（PPP）氧化支路突变会产生类似GalNAc的敏感表型。这项工作为理解营养微环境如何调控细菌-噬菌体互作提供了新视角。

　　

ABSTRACT

人类肠道微生物群包含数百种细菌物种，其中一些能在感染它们的裂解性噬菌体存在下持续存在。拟杆菌属（Bacteroides）采用多种相变策略在噬菌体存在下生存，包括荚膜多糖（CPS）和S层脂蛋白。先前研究发现，缺乏CPS的Bacteroides thetaiotaomicron菌株在强制表达S层蛋白BT1927时对多种噬菌体表现出几乎完全的抗性。但这种抗性仅在特定生长条件下出现，表明营养变量改变了感染和抗性。本研究通过在多种简单糖和多糖上培养该菌株，发现某些底物（如果糖、葡萄糖）促进对单一噬菌体（ARB25）的强抗性，而其他底物如N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）和黏蛋白O-糖链则增加敏感性。混合果糖和GalNAc的实验表明GalNAc的影响占主导地位。

INTRODUCTION

人类肠道是共生微生物群落（微生物组）的家园，这些微生物为宿主提供有益功能，包括复杂碳水化合物等营养素的消化和代谢、免疫刺激以及病原体防护。组成微生物组的单个细菌物种经常遇到扰动，包括饮食变化、渗透压应激、免疫反应、抗生素和暴露于噬菌体，所有这些都可能限制单个细菌的持久能力。噬菌体是人类肠道中最丰富的生物实体，针对特定物种。噬菌体的存在可能对微生物组组成以及宿主产生影响，如果它们能够根除目标细菌物种并消除其有益功能。尽管噬菌体有造成此类破坏的潜力，但纵向人类研究表明，大多数细菌菌株可以长期稳定存在。

Carbohydrates influence BT1927 S-layer-mediated phage resistance

通过使用支持B. thetaiotaomicron生长的14种单糖和13种多糖面板，测量了BT1927:ON菌株在ARB25感染期间的生长动态。几种碳水化合物导致与葡萄糖类似的生长，例如果糖也促进在ARB25存在下强劲且不间断的早期生长增加。相比之下，其他碳水化合物引发的生长更类似于未老化或未传代的BT1927:ON或BT1927:OFF菌株在葡萄糖中的生长。例如，在含有GalNAc的培养基中生长导致ARB25暴露后的初始生长增加受到抑制，并在初始感染后约40小时内保持较低水平。量化热灭活和ARB25感染培养物之间在前24小时内的曲线下面积（AUC）差异显示，果糖和GalNAc分别表现出最高和最低的抗性。多糖中导致抗性降低最多的是黏蛋白O-糖链（MOG），这是一种有趣地含有单糖GalNAc的寡糖混合物。

N-acetylgalactosamine reduces the presence of BT1927 on the bacterial surface

使用流式细胞术测量带有C末端FLAG表位的BT1927变体（BT1927:ON^F）的表面表达发现，在果糖中生长的BT1927:ON^F菌株可以通过抗FLAG表位的抗体与在相同培养基中生长的BT1927:OFF菌株清晰区分。在GalNAc中生长的BT1927:ON^F菌株与果糖培养物明显不同，平均几何平均荧光强度（MFI）为200 ± 62（GalNAc）对比578 ± 64（果糖），尽管GalNAc的表面染色明显高于BT1927:OFF对照。这一结果表明GalNAc生长的细胞在细胞表面表达更少的BT1927。

一个有趣的观察是，在果糖中培养的BT1927:ON^F细胞中存在一个 distinct 群体，其染色与BT1927:OFF对照相似。这解释为在某些情况下，可能存在一个细胞群体，尽管表达被锁定在开启状态且果糖促进群体中的整体强ARB25抗性，但细胞表面相关的BT1927表达非常少。这双峰群体可能反映了最初通过SEM成像在葡萄糖中生长的细胞观察到的两个群体。

由于GalNAc减少了表面相关的BT1927蛋白量，研究接下来确定了这种效应在表达的哪个点施加。比较在GalNAc或果糖中（无噬菌体情况下）的BT1927:ON菌株发现，BT1927转录本并未因GalNAc而减少。类似地，在另一种增加ARB25敏感性的碳水化合物葡萄糖胺上生长时，也观察到高BT1927转录。通过蛋白质组学使用LC-MS/MS测量在果糖或GalNAc中生长的BT1927:ON菌株中BT1927的相对标准化蛋白质丰度，发现BT1927的丰度在GalNAc中生长并未显著降低。因此，尽管GalNAc增加了ARB25敏感性并减少了细胞表面的BT1927丰度，但没有证据表明GalNAc减少了BT1927脂蛋白的转录或翻译，因此表面表达的缺乏必须发生在BT1927分泌或运输到膜外叶、其折叠形成有效S层或其保留在细胞表面的水平上。

有趣的是，当进行额外的SEM以尝试可视化B. thetaiotaomicron表面的BT1927晶格时，注意到在围绕B. thetaiotaomicron细胞的上清液中外膜囊泡（OMV）显著增加。使用固定和全载细菌培养物（即含有培养基上清液）的图像通过先前发表的方法量化OMV发现，在GalNAc中生长使细胞外OMV的数量增加了约25倍。

The oxidative branch of the pentose phosphate pathway regulates susceptibility to phage

碳水化合物利用由B. thetaiotaomicron和其他拟杆菌属是一个高度调控的过程，涉及多层调控。多糖利用通过底物特异性多糖利用位点（PULs）的表达发生，这些基因簇通常在其目标多糖响应下表现出转录的大幅增加（50至>1,000倍）。PUL调控最常见由局部作用、正作用的转录因子介导。然而，全局调控现象——仍然不完全理解——也存在以控制B. thetaiotaomicron中的多糖和单糖利用，并且至少多糖利用受到分解代谢物抑制样效应（即一些多糖被赋予高优先级，而其他多糖的利用被抑制直到首选底物耗尽）。

为了确定PPP或Cur中的突变体是否影响ARB25抗性，测量了三个先前鉴定的转座子突变体在PPP氧化支路中具有 disrupted 基因的生长（在相同的Δcps菌株背景中，缺乏所有八个荚膜多糖，用于本研究中的其他实验）。这些突变体，没有BT1927启动子锁定开启，在感染ARB25时表现出相对于未处理的 acapsular B. thetaiotaomicron菌株（具有功能性PPP）的受损生长，表明在部署其仍保留的多种相变蛋白（包括BT1927）方面存在缺陷。值得注意的是，先前发现BT1223中的突变体，编码一个推定的二羧酸转运蛋白，同样减少了蛋白质BT4295的表达，该蛋白质是T细胞表位的来源，与编码PPP氧化支路三个步骤的相邻基因中的插入类似。

鉴于这些发现，评估了删除BT1222基因（编码PPP氧化支路的终端步骤）在BT1927:ON菌株中的效果。删除BT1222导致在果糖中生长时对ARB25的抗性减弱。与其在含有果糖的液体培养基中明显增加的敏感性一致，ΔBT1222 BT1927:ON菌株显示与BT1927:ON亲本相比斑块数量增加，尽管当两者在含有果糖的培养基中生长时比亲本 acapsular 菌株少。鉴于与删除BT1222相关的敏感性增加，测量了BT1927转录水平并确认表达在ΔBT1222突变体中保持不变。类似于显示增加ARB25敏感性的GalNAc生长细胞，通过Western印迹也没有看到BT1927蛋白质的显著减少。最后，使用流式细胞术，观察到当ΔBT1222 BT1927:ON^F菌株在果糖中生长时BT1927表面染色减少，尽管这种差异 barely 达到显著性。

最后，检查了全局调节器Cur的作用，它与PPP氧化支路有一些共同的调控。在相同的Δcps菌株背景中删除编码Cur（BT4338）的基因的突变体，或BT1927:ON菌株本身，在果糖中生长时并没有像PPP突变体那样 substantially 增加敏感性，尽管观察到一些增加的ARB25敏感性。在表位标记的BT1927:ON^F菌株中缺乏Cur的流式细胞术也显示出与在果糖中生长的亲本菌株类似的强烈染色。然而，由于果糖是减少Cur功能的两种糖之一，可能在果糖中生长的野生型参考中Cur抑制是我们未能检测到Cur删除效果的原因。作为Cur作用的额外测试，在GlcNAc中生长时测量了ARB25抗性，这是一种不需要Cur以实现高效生长的糖，但促进与GalNAc类似的敏感性。该实验也未能揭示Cur在介导敏感性中的突出作用，因为Cur突变体在GlcNAc中生长时仍然表现出高敏感性。总之，得出结论，完整的PPP氧化支路的存在是在果糖中生长期间BT1927介导的噬菌体抗性所必需的，但Cur似乎几乎没有可观察到的作用。

DISCUSSION

噬菌体是许多微生物环境中最众多的生物实体，包括人类肠道。至少一些个体噬菌体的存在随时间稳定，提出了噬菌体如何能够在不清除其宿主细菌或当宿主获得抗性时丢失的情况下保持存在的问题。虽然现象如溶原性和假溶原性在这些关系中起作用，但多个拟杆菌属物种在过去的几十年中已被证明，使用体外和体内实验，与裂解性噬菌体共存于一种状态，其中 neither 完全获胜或失败。这种现象是由相变抗性机制的存在驱动的，这些机制 presumably 在噬菌体存在时以其“开启”状态被选择，但以足够的频率回复到“关闭”状态，以 continuously 生成易感的猎物细菌被感染和补充噬菌体群体。

哺乳动物肠道中的碳水化合物景观复杂且动态，并且直接影响组成肠道微生物群的细菌的代谢。饮食是塑造微生物群的主要外部力量，因为膳食纤维——主要包括除可溶性淀粉之外的植物源性多糖——是人类食物中未被人酶吸收或消化而到达结肠的主要部分。B. thetaiotaomicron是一种营养通才，可以利用多种膳食纤维，但也可以消耗附着在分泌的胃和结肠黏蛋白上的多样化O-糖链。先前已经表明，一些可被B. thetaiotaomicron获取的膳食纤维多糖通过类似于碳分解代谢物抑制的现象抑制了该生物体 involved 在黏蛋白O-糖链降解中的PULs的表达。当从定植有B. thetaiotaomicron的 gnotobiotic 小鼠中 withhold 膳食纤维时， involved 在O-糖链利用中的PULs表达增加，并且可测量地增加黏液消耗，表现为更薄的结肠黏液。

B. thetaiotaomicron PULs通常由从较大多糖切割的寡糖线索激活。然而，两个 involved 在利用含果糖（BT1757-63）和核糖营养素（BT2803-09）的PULs由这些相应的简单糖激活。有趣的是，在这两种糖上生长引发了不同的抗性效果，表明PUL相关蛋白质表达的存在并不干扰或协助BT1927介导的噬菌体抗性。如结果中所述，简单糖的效果与包含那些相同糖的所有多糖的效果之间没有明确的关系。也许这种不一致最 striking 的例子是硫酸软骨素（CS）的效果，这是一种50% GalNAc的聚合物，但相对于未感染的对照，导致敏感性增加很少，与单独的GalNAc形成对比。有趣的是，当 presented 在多糖混合物中时，CS被B. thetaiotaomicron赋予高优先级，而MOG被赋予低优先级。虽然这些聚糖都含有GalNAc，但可能这些营养素被优先化的仍然未知的机制在它们通过BT1927对ARB25抗性的效果中起作用。然而，CS中另一个突出糖（GlcA）以某种方式覆盖GalNAc的效果似乎不太可能，因为在单独的GlcA上生长也导致敏感性增加。

也许本研究中最意想不到的观察是在B. thetaiotaomicron中检测到 what appear to be 细胞命运决策，这些决策在单细胞水平上 manifest。支持这一点的证据首先来自BT1927:ON和BT1927:OFF菌株的SEM成像，以及观察到多达~40%的BT1927:ON细胞缺乏先前与BT1927表达相关的晶格状表面结构，而是类似于BT1927:OFF菌株。支持这一观点的额外证据来自观察，即一些在果糖中生长的BT1927:ON^F菌株培养物 harbor 一个 significant 细胞群体，通过流式细胞术类似于BT1927:OFF。据广泛报道，拟杆菌属物种编码多种机制以在群体中产生表型多样性。这种多样性 pre-adapts 亚群以 survive 挑战，如宿主先天和适应性免疫反应以及噬菌体。除了上述直接影响噬菌体和免疫成分抗性的相变CPS、S层和其他功能外，额外的相变事件包括相变DNA甲基化系统的存在，这些系统在全局尺度上改变各种细胞特征，包括CPS表达。虽然这些系统仅在B. fragilis中得到研究，但B. thetaiotaomicron有两个编码该系统的基因座拷贝（BT4516-4523和BT4535-BT4543），并且可能通过甲基化表现出类似的表观遗传调控。此外，相变基因 shufflons 存在于B. thetaiotaomicron中，通过单个转录因子多样化表达的特定营养素受体。确实，先前观察到这些营养素受体 shufflons 中的一个 pronounced 转变 in vitro after B. thetaiotaomicron暴露于ARB25，并且允许出现抗性细胞群体。虽然重要的是要注意，对此假设进行测试以了解ARB25和感染时观察到的营养素受体（通过删除 involved 基因）并未支持作为ARB25受体的直接作用。最后，最近的一项研究证明了在B. thetaiotaomicron基因组中存在更普遍的DNA倒位（372种不同的“inverton”事件），这些事件通常发生在编码序列内，并且与介导倒位的已知重组酶无关。虽然仍有待研究，但这种大量的基因组变异 holds 记录本报告中报道的营养记忆方面的潜力，例如，通过将基因组组织转移到不同的甲基化或重组状态，然后当细胞遇到另一种底物时需要时间转移回来。

尚不清楚BT1927如何保护 against 噬菌体或在先前的工作中 against 补体介导的 killing。鉴于当这种蛋白质高度表达时在细胞表面上观察到的突出结构组织，一个明显的假设是它在物理上阻止了补体沉积或孔形成或噬菌体吸附的访问。由于ARB25表面受体仍然未知，因此尚不清楚细菌表面需要被BT1927覆盖多少以保护细胞。确实，这可能不是一个全有或全无的事件，而是更高的表面覆盖百分比降低了噬菌体访问其受体并感染细胞的几率。这种现象可以解释在GalNAc生长的细胞中观察到的 higher 斑块形成率和更清晰的斑块，以及在液体培养物中经常观察到的“中间”生长 of BT1927:ON在GalNAc或含有GalNAc和果糖的条件下生长，既不实现完全生长也不实现完全裂解。在后一种情况下，受保护细胞的生长和未受保护细胞的 killing 可能相互平衡，导致通过吸光度测量的细胞数量几乎没有正或负变化。未来的工作以识别ARB25受体将开辟途径以开始更详细地探索这些潜在机制，例如，通过增加或减少ARB25受体的量，并观察那些变化如何影响在果糖或GalNAc中生长时的 killing。

我们的研究支持噬菌体与肠道细菌之间动态相互作用的模型，这种模型受到肠道中存在的碳水化合物的影响。在营养素如GalNAc和O-糖链存在下，抗性蛋白质如BT1927的有效性降低 may 解释为什么B. thetaiotaomicron拥有如此多不同的策略（即其他抗性策略如荚膜可能在