芽孢内膜蛋白家族缺失对芽孢杆菌孢子抗性与萌发的影响及其蛋白定位研究

本综述聚焦于芽孢杆菌（Bacillus）孢子内膜（IM）中一类新型整合膜蛋白家族（包括YetF、YrbG等）的功能研究。通过基因敲除实验，发现这些蛋白的缺失会显著降低孢子对湿热、甲醛（HCHO）和过氧化氢（H2O2）的抗性，并影响萌发速率。研究还揭示了这些蛋白通过调节内膜流动性（如FRAP和Laurdan荧光分析所示）和稳定性，进而调控萌发通道（如SpoVA）的自发开放机制。此外，利用GFP融合蛋白技术明确了YetF在孢子内膜中呈5–7个点状分布，提示其可能参与形成特殊膜微域。该研究为理解孢子休眠与复苏的分子机制提供了新视角，对控制食品腐败和病原菌传播具有重要应用价值。

　　

ABSTRACT

芽孢杆菌（Bacillus）的孢子处于休眠状态，对热和化学物质具有高度抗性，但在萌发过程中可恢复生命活动。某些菌种或菌株的孢子会导致食品腐败或疾病。近期研究发现，枯草芽孢杆菌（B. subtilis）孢子内膜（IM）中存在一个由5个同源蛋白组成的家族，其中两个成员对孢子抗性和萌发至关重要。YetF是该家族中含量最丰富的蛋白。本研究显示，缺失任一同源蛋白均会降低孢子对热和化学物质的抗性，且缺失多个同源蛋白时抗性下降更显著。此外，缺失YetF及其同源蛋白会减慢孢子萌发速率，而缺失第二丰富的同源蛋白YrbG则会加速萌发。出乎意料的是，同时缺失YetF和YrbG的孢子会在孢子形成早期自发萌发。尽管这种自发萌发不涉及正常的萌发受体（GRs）或皮层肽聚糖裂解酶（CLEs），但通过过表达CaDPA释放的IM通道（SpoVA）可加速该过程。多种同源蛋白的缺失会显著增加IM流动性，这可能对孢子抗性和萌发产生重要影响。值得注意的是，功能性的YetF-GFP融合蛋白在野生型枯草芽孢杆菌孢子及缺失孢子和外膜的孢子中定位于5–7个IM斑点，但这些斑点的功能尚不清楚。在巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）的YetF-GFP孢子中也观察到类似斑点，而ydfS缺失孢子的湿热抗性降低。显然，这些新型蛋白可能带来更多惊喜！

IMPORTANCE

芽孢杆菌门（Bacillota）的孢子是食品腐败和疾病的载体，且难以杀灭，例如枯草芽孢杆菌孢子在90°C的湿热条件下仅缓慢死亡。孢子的湿热抗性受多种因素影响，包括孢子核心的低水分含量和DNA保护蛋白。近期，一组孢子特异性内膜（IM）蛋白被鉴定为可增加IM刚性和孢子湿热抗性。枯草芽孢杆菌有5种此类蛋白，所有芽孢杆菌和梭菌（Clostridium）物种均存在多个同源蛋白。这些蛋白可增加IM刚性，从而提高孢子湿热抗性，并可加快或减慢孢子萌发速率，对巨大芽孢杆菌孢子也有类似效应。因此，这些蛋白是影响孢子特性的新因素。

INTRODUCTION

某些厚壁菌门（Firmicute）物种的孢子是食品腐败、食物中毒和疾病的主要媒介。孢子对多种因素具有极端抗性，包括湿热、干热、各种波长的辐射以及多种化学物质。研究最广泛的孢子抗性是湿热抗性，芽孢杆菌孢子的耐受温度比其营养细胞高约40°C。至少7种因素贡献于枯草芽孢杆菌孢子的湿热抗性，其中一些因素如孢子核心积累约25%干重为Ca²⁺与吡啶二羧酸（DPA）的1:1螯合物（CaDPA）在约70年前已被鉴定，而第七种因素近期被鉴定为两组同源的枯草芽孢杆菌孢子内膜（IM）蛋白。这些IM蛋白仅在孢子形成晚期合成，不仅对孢子抗性有显著影响，还对孢子萌发有重要影响。

枯草芽孢杆菌孢子的萌发通常由萌发剂如特定氨基酸和糖触发，这些萌发剂激活孢子IM中的萌发受体（GRs）。GR激活后导致孢子IM SpoVA蛋白通道开放，从而快速释放所有核心CaDPA。CaDPA释放随后触发位于IM外的胚细胞壁与孢子壳之间的大肽聚糖皮层的降解，由两种冗余的皮层裂解酶（CLEs）CwlJ和SleB完成，从而导致孢子萌发完成。

本研究考察了上述整合IM蛋白同源物的缺失对枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌孢子特性的影响，包括：（i）对湿热、甲醛（HCHO）和过氧化氢（H₂O₂）的抗性；（ii）不同萌发剂下的萌发以及自发萌发；（iii）孢子IM流动性和通透性；以及（iv）这些蛋白中两个同源物在孢子IM中的具体位置。本研究的结果为了解休眠孢子的特性提供了新见解，这些特性对其抗性和萌发能力至关重要，并开辟了多条进一步研究的途径。

MATERIALS AND METHODS

Strain construction

本研究使用的枯草芽孢杆菌菌株与实验室168菌株PS832同源，并列于表S1。大多数突变菌株通过用来自芽孢杆菌遗传保藏中心的菌株的基因组DNA进行转化构建，其中编码基因被抗生素抗性标记替换；在某些情况下，通过Cre重组酶的作用去除抗生素抗性基因。在其他情况下，使用Setlow实验室先前生成的菌株的DNA进行转化。对缺失三个或多个同源物的菌株的基因组DNA进行了测序，以确认这些菌株的基因型。通过将编码yetF起始密码子上游200 bp序列加上与超折叠gfp ORF框内融合的yetF ORF的PCR扩增产物克隆到质粒pDG1662 AmyE整合载体中，构建了表达YetF与GFP融合且受野生型yetF启动子控制的枯草芽孢杆菌野生型（wt）和ΔyetF菌株。将所得载体导入感受态野生型和ΔyetF枯草芽孢杆菌菌株，并通过PCR和测序验证。

巨大芽孢杆菌ΔydfS菌株通过等位基因交换制备，在该基因座（BMQ_1954）引入被卡那霉素抗性盒中断的截短版本基因，使用先前描述的PEG介导的转化方案。通过Klenow组装制备pUCTV2 ΔydfS::Km质粒，其中覆盖ydfS ORF的5'和3'端500 bp的PCR扩增产物位于从质粒pDG792扩增的卡那霉素抗性盒的两侧，并克隆到线性化的温度敏感型pUCTV2中。通过PCR和测序验证了与野生型QM B1551菌株同源的巨大芽孢杆菌ΔydfS菌株。如同常见情况，诱变过程导致天然165 kb pBM700质粒丢失，该质粒携带gerU和相关gerVB萌发受体基因，以及编码YetF同源物的BMQ_pBM70026。通过在低拷贝附加体pHT315质粒上引入杂交gerUV操纵子，避免了ΔydfS菌株中gerU的缺失。该质粒还用于通过ydfS-gfp构建体（通过Klenow组装制备，包括yetF和超折叠gfp ORF之间的GGGGS柔性接头）互补ΔydfS菌株，该构建体 preceded by 200 bp的上游序列，即置于天然启动子序列控制下。以类似方式制备编码巨大芽孢杆菌yetF-gfp的质粒，并通过PEG介导的转化导入野生型细胞。

Spore preparation and purification, and spontaneous spore germination

枯草芽孢杆菌菌株在37°C的2× SG培养基琼脂平板上孢子化，如先前所述。通常，约3天后孢子从孢子囊中释放基本完成，将孢子刮入冷水中，并通过反复离心、水洗和间歇超声进行纯化。最终纯化步骤是通过50% Histodenz高密度溶液离心，其中休眠孢子沉淀，萌发芽孢和碎片漂浮。将沉淀的孢子用冷水洗涤以去除Histodenz，并在4°C避光保存，光密度（OD₆₀₀）为10–30。最终孢子制备物也间歇性地通过相差显微镜检查，以确保孢子保持休眠。几乎所有孢子制备物都是如此，除了一些缺失多个IM同源物的菌株，这些菌株虽然在孢子囊中最初产生相亮孢子，但在母细胞裂解后很快出现大量萌发。

在一项实验中，将孢子留在37°C平板上48小时，并间歇性地从平板小区域刮取小样本，通过相差显微镜检查确定休眠（相亮）和萌发（相暗）孢子的百分比；样本还用BacLight试剂染色，以识别已萌发且存活（染成绿色）或死亡（染成红色）的孢子。在平板孢子化培养6天的过程中，在不同时间从平等等小区域刮取孢子，悬浮于2 mL冷水中，离心后保存上清液；向沉淀中加入2 mL水，悬浮，煮沸30分钟以释放CaDPA，冷却后离心，再次保存上清液。将两种上清液的等分试样（5、10和25 μL）加入荧光比色杯，使25 mM K-Hepes缓冲液（pH 7.4）和50 μM TbCl₃总体积为200 μL，并如所述测量Tb-DPA荧光。

巨大芽孢杆菌孢子在补充营养肉汤（SNB）中于30°C摇床（225 rpm）培养72小时制备，并如先前所述收获和纯化。通过将野生型和ΔydfS菌株在SNB中孢子化，72小时后将轨道振荡降低至100 rpm，随后取样进行相差显微镜检查和成像超过25天，评估巨大芽孢杆菌孢子的自发萌发。

Spore killing

为评估枯草芽孢杆菌孢子被湿热杀灭的情况，将OD₆₀₀约为1（约10⁸孢子/mL）的孢子在90°C或93°C的无菌水中孵育。在不同时间，将50 μL等分试样加入450 μL冷无菌水中，并将十分之一稀释液进一步系列稀释10倍至1/10⁶于无菌冷水中。通过将10 μL等分试样重复点样在网格中于溶菌肉汤（LB）培养基平板上测定孢子存活力，需要时添加适当抗生素。应用液体在平板上干燥后，于30°C孵育过夜，然后在37°C孵育直至不再出现菌落，并计数菌落。如先前所述，在23°C用H₂O₂和HCHO杀灭孢子，并将等分试样在用溶液灭活所用化学品中稀释十分之一，孵育约30分钟，然后进一步在水中系列稀释十分之一，并将多个稀释度的等分试样重复应用于LB平板，如湿热抗性分析所述孵育并计数菌落。

通过将100 μL等分试样的孢子（OD₆₀₀为1；约10⁸孢子/mL）在75°C无菌水中孵育，测定巨大芽孢杆菌孢子的湿热抗性。在30、60和90分钟后取样，冷却并用冰镇无菌水稀释10倍，然后在水中系列稀释，之后一式三份铺于LB平板上。在30°C过夜孵育后计数菌落。

Spore germination

用GR依赖性萌发剂L-缬氨酸或L-天冬酰胺、D-葡萄糖、D-果糖和KCl（AGFK）混合物，或非GR依赖性萌发剂十二胺（直接打开SpoVA IM CaDPA通道）萌发枯草芽孢杆菌菌株孢子。如所述，通过用Tb³⁺监测DPA荧光测量L-缬氨酸、AGFK和十二胺的孢子萌发。上述GR依赖性萌发 preceded by 70°C热激30分钟（L-缬氨酸）或2小时（AGFK）以同步萌发，但十二胺萌发不需要。200 μL萌发孵育为：（i）在37°C用10 mM L-缬氨酸在200 μL 25 mM K-Hepes缓冲液（pH 7.4）加50 μM TbCl₃中，孢子OD₆₀₀为0.5；和（ii）在37°C用10 mM各L-天冬酰胺、D-葡萄糖、D-果糖和KCl在25 mM K-Hepes缓冲液（pH 7.4）中，孢子OD₆₀₀为0.5，加50 μM TbCl₃。通过加入孢子开始萌发，并在荧光板阅读器中测量Tb-DPA荧光。对于十二胺萌发，将OD₆₀₀为1的孢子在45°C孵育于2 mL 1 mM十二胺在5% DMSO和25 mM K-Hepes缓冲液（pH 7.4）中。在不同时间，将100 μL等分试样加入100 μL 100 μM TbCl₃在25 mM K-Hepes缓冲液（pH 7.4）中，并测量Tb-DPA荧光。所有萌发均重复进行，数据取平均。

巨大芽孢杆菌孢子萌发通过吸光度损失和DPA释放测定监测，使用的孢子已在60°C热激活10分钟并随后冰上冷却。吸光度测定使用96孔板，加入20 μL OD₆₀₀为4的孢子至180 μL等分试样的5 mM Tris-HCl（pH 7.5）补充10 mM D-葡萄糖，初始OD₆₀₀为0.4。用粘性薄膜密封平板以防止蒸发损失，并在30°C于Tecan Infinite-200系列振荡孵育板阅读器中孵育，配备600 nm光度滤光片。每次吸光度测量后对平板进行10秒轨道振荡，每分钟收集一次数据，持续2小时。DPA释放的萌发测定涉及将20 μL孢子加入黑色微孔板孔中，其中含有180 μL上述葡萄糖-Tris缓冲液混合物加50 μM TbCl₃。通过监测620 nm发射荧光（激发337 nm）90分钟在30°C下使用BMG Labtech CLARIOstar微孔板阅读器在均相时间分辨荧光模式下运行并轨道振荡测量DPA释放。萌发实验使用至少两个独立制备的孢子批次进行，平均值的标准偏差<10%。

Fluorescence redistribution after photobleaching (FRAP) analysis, and other measurements of IM fluidity and permeability

在液体孢子化中用约5 μM 2,4-di-ANEPPS染料标记发育中的枯草芽孢杆菌孢子，并如上所述纯化孢子。将纯化的标记孢子进行荧光漂白后重分布（FRAP）分析，基本如先前所述， except that 扩散系数和可动分数通过将实验结果与使用Virtual Cell（VCell）软件开发的FRAP实验3D计算模型模拟结果进行比较来估计。VCell BioModel“Bacillus Spore Membrane new FRAP Analysis”在用户名“ACowan”下可在https://vcell.org获取的VCell软件中访问。VCell BioModel修改自中描述的BioModel，并考虑了监测期间的漂白和漂白后的去淬灭，两者均在对照实验中确定，以及漂白后重分布期间的扩散。

作为孢子IM流动性的另一测量，用50 μg/mL Laurdan标记枯草芽孢杆菌野生型和PS4531菌株孢子于用于孢子制备的平板中，并如上所述制备和纯化孢子。注意被吸收的Laurdan保留在纯化孢子和IM中。用405 nm激发Laurdan荧光，并测量30–40个单个孢子在440和490 nm的荧光发射，包括几个萌发孢子，并取两个波长发射强度的比率作为IM流动性的量度。还如先前所述测量了¹⁴C-甲胺跨孢子IM进入休眠孢子核心的通透性。

Fluorescence microscopy of spores carrying various fluorescent fusions

使用Zeiss Elyra 7超分辨率结构照明显微镜（SR-SIM）获得携带YetF-GFP的枯草芽孢杆菌孢子的荧光和明场图像。将完整孢子（5 μL于水中）点样到1%琼脂糖包被的玻片上，然后加盖玻片。通过488 nm（氩激光）激发的二维SIM获得荧光成像，并用63×物镜（alpha Plan-Apochromat 63×/1.46 Oil）在515 nm收集发射。使用透射光和滤光片组BP 570-620 + LP 655获得明场图像。使用Fiji软件和Adobe Photoshop进行图像处理和呈现。使用配备×100油浸物镜、相差光学系统和用于采集绿色荧光的滤光片组的Olympus BX53显微镜（Olympus Life Sciences, UK）对巨大芽孢杆菌孢子成像。所得图像使用Fiji软件（ImageJ）处理。

RESULTS

B. subtilis spore resistance

先前工作表明，缺失YdfS或YetF（枯草芽孢杆菌五个孢子特异性整合IM蛋白家族中两个相似同源物）会导致孢子对湿热以及H₂O₂和HCHO的抗性降低。因此，考察缺失编码其他三个同源物中任一或多个同源物的孢子的抗性特性令人感兴趣。不足为奇，单独缺失yrbG、ydfR或ykjA或一起缺失会导致孢子湿热抗性降低，保留YdfR和YetF的三重突变体（菌株PS4531）具有最低的热抗性。我们制备了缺失所有五个同源物的五重突变体，但该菌株非常不稳定，在从孢子囊释放后很快萌发，如同缺失yetF和yrbG以及有或无其他同源物的孢子。当检查对H₂O₂或HCHO的抗性时，也观察到缺失多个这些蛋白同源物的累积效应，保留YetF和YdfS的三重突变体对这些试剂具有最低的抗性。

B. subtilis spore germination

先前工作还表明，缺失YetF或YdfS会导致孢子用GR依赖性萌发剂L-缬氨酸萌发显著减慢。这在当前工作中也观察到，缺失ydfR导致类似萌发减慢。然而，缺失yrbG或ykjA导致L-缬氨酸萌发比野生型孢子更快，并且在双突变体和三突变体中这种效应更加显著。对AGFK萌发也观察到类似于L-缬氨酸萌发的效应，在一些单突变体中萌发较慢，但再次，双突变体和三突变体孢子通常用AGFK萌发显著快于野生型孢子。这些突变对十二胺萌发的效应不同，因为所有突变体孢子用这种GR非依赖性萌发剂萌发更快，并且三突变体孢子表现出最快的十二胺萌发。

我们还测试了抗生素标记对缺失三个或四个同源物的枯草芽孢杆菌孢子萌发的影响，因为近期工作表明整合的外源DNA可对孢子蛋白质组有显著影响，从而可能影响孢子特性。确实， otherwise 同源的带有一个或两个抗生素标记的孢子在抗生素标记被去除后萌发更慢。然而，未进一步研究这种效应背后的原因，尽管在处理带有抗生素标记的菌株孢子时需要记住这种现象。

Spontaneous germination of spores lacking both YetF and YrbG

如上所述，缺失多个YetF家族同源物（包括两个最丰富的IM同源物YetF和YrbG）的枯草芽孢杆菌菌株孢子在孢子化平板上自发萌发。对于仅缺失yetF和yrbG的孢子也是如此，如在跟踪孢子化培养物自发CaDPA释放的实验中所见，并通过显微镜测量四突变体孢子。与缺失YetF和YrbG的孢子在形成后早期快速自发萌发相反，单独缺失YetF、单独缺失YrbG或缺失其他同源物中的一个、两个或三个的孢子未表现出显著的自发萌发。

缺失YetF和YrbG孢子的自发萌发是完整的，因为孢子在相差显微镜中变暗，表明CaDPA释放和皮层水解均已发生。一个明显的问题是为什么这种自发萌发会发生。一种可能性是因为GRs或CLEs CwlJ和/或SleB在缺失YrbG和YetF的孢子中被激活，这种激活随后触发萌发。或者，也许IM SpoVA蛋白的CaDPA通道在YetF和YrbG缺失时自发打开，释放的CaDPA随后触发皮层裂解和萌发完成。为了在这些解释之间做出决定，我们使用了缺失YetF和YrbG的菌株，其孢子在从孢子囊释放后很快萌发。一个额外菌株PS4530还缺失所有五个枯草芽孢杆菌GRs，而其他菌株缺失孢子两个冗余CLEs CwlJ、SleB或两者的基因。注意所有这些菌株但一个（PS4538缺失 both CLEs CwlJ和SleB）的孢子具有释放CaDPA然后水解孢子皮层的能力。然而，尽管cwlJ sleB孢子在GR刺激下可以释放CaDPA，它们不能水解孢子皮层PG。因此，这些孢子不完成萌发，在相差显微镜中保持 somewhat 亮，尽管不如不释放CaDPA的孢子亮。然后我们测量了野生型孢子和缺失yetF和yrbG的突变菌株孢子在接种孢子化平板后最多6天内保留的CaDPA。该分析显示，缺失所有GRs或 either CwlJ或SleB的yetF yrbG孢子释放CaDPA与缺失yetF和yrbG的孢子相似。然而， also lacking cwlJ和sleB的yetF yrbG菌株孢子化细胞的CaDPA释放慢于其他 except wt孢子。确实，发现缺失 both CwlJ和SleB会减慢 otherwise wt孢子的萌发中的CaDPA释放。此外，具有yrbG yetF突变单独或有或无GRs或CwlJ或SleB的孢子中保留的少量CaDPA等于从孢子囊释放后6天仍相亮的这些孢子的 small 百分比。

together，上述结果与ΔyrbG ΔyetF孢子中SpoVA通道自发打开一致，导致它们自发萌发，因为CaDPA释放 alone 触发枯草芽孢杆菌孢子萌发的后续事件， even in the absence of GRs。为了测试这个想法，在野生型菌株和缺失yrbG或yetF的菌株中 spoVA操纵子的启动子强度增加了约4倍；然后这些菌株在平板上孢子化，并测量它们的萌发以及具有较弱野生型spoVA启动子的野生型、yetF和yrbG菌株孢子的萌发。该实验的结果 striking，因为尽管更强的spoVA启动子增加野生型和yetF孢子的自发萌发至多约25% within 7天，但具有更强spoVA启动子的yrbG孢子在仅约2天内几乎完全自发萌发。

Influence of YetF-type proteins in B. megaterium spores

在确定YetF型整合IM蛋白显著影响枯草芽孢杆菌孢子特性后，我们接下来试图确定类似观察是否扩展到其他芽孢杆菌门孢子。巨大芽孢杆菌QM B1551（一种在系统发育上与枯草芽孢杆菌 quite distinct 的物种）的基因组编码9个YetF型蛋白同源物，包括在每个大内源质粒上有一个。我们决定尝试在序列同一性最接近枯草芽孢杆菌YetF（BMQ_2888）或YdfS（BMQ_1954）的同源物中创建缺失突变，在后者成功。所得巨大芽孢杆菌ydfS菌株发现在诱变过程中自发切除了BM700质粒， thereby 丢失在BMQ_pBM70026基因座编码的同源物并无意中创建了双突变体菌株。通过营养耗竭在SNB中制备双突变体菌株（为简单起见称为巨大芽孢杆菌ydfS）孢子，并观察到孢子化正常进行。然后测定孢子的湿热抗性和萌发特性。值得注意的是，巨大芽孢杆菌ydfS孢子比野生型孢子热抗性低，在75°C孵育30分钟后存活力 near one-log reduction relative to wt孢子，并在孵育1小时后仅保留5%存活力。该缺陷通过用质粒携带的ydfS-gfp互补 largely restored，表明后者融合是功能性的。引入质粒携带的gerUV也意外地增强了ydfS孢子的热抗性，尽管在75°C孵育30分钟后存活力仍不到野生型孢子的一半。后者观察意外，因为缺失pBM700质粒（包括gerUV）的巨大芽孢杆菌孢子在LB平板上的 colony-forming ability 与野生型孢子相当；因此，也许从pHT315 modest overexpress gerUV在恢复ydfS孢子一定程度的热抗性中有作用。在85°C孵育的野生型和ydfS孢子