在耻垢分枝杆菌中组装结核分枝杆菌ESX-1分泌系统揭示新型转录激活因子和结核疫苗候选物

本研究成功在非致病性耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）中组装了功能性结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）ESX-1型VII分泌系统（T7SS），发现该工程化菌株（MSX-1）能高效分泌ESX-1效应蛋白（EsxA、EsxB、EspB等）但不增强致病性。研究首次鉴定出Rv3860为esx-1基因簇（pe35/ppe68/esxB/esxA）的关键转录激活因子，并证明MSX-1在小鼠模型中提供与BCG疫苗相当的抗结核保护力，且不干扰结核菌素诊断试验。该工作为ESX-1机制研究和新型结核疫苗开发提供了创新平台。

　　

ABSTRACT

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, M. tb）利用其ESX-1型VII分泌系统（type VII secretion system, T7SS）输出免疫原性蛋白效应因子以介导毒力。本研究对快速生长且非致病性的耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）mc²155模型菌进行工程化改造，使其表达结核分枝杆菌的ESX-1系统。研究发现，仅转入M. tb esx-1基因座的耻垢分枝杆菌，以及同时转入esx-1和espACD操纵子（命名为MSX-1）的菌株，均能产生并分泌M. tb ESX-1蛋白效应因子EsxA、EsxB和EspB。然而，这些蛋白在MSX-1菌株的胞内及培养上清中的丰度更高。尽管ESX-1对M. tb致病性至关重要，但表达M. tb ESX-1并未使重组耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内获得毒力。一个偶然的发现是，在本研究中用改造的esx-1基因座转化耻垢分枝杆菌时，揭示出功能此前未知的基因rv3860是pe35、ppe68、esxB和esxA基因转录所必需的。最后，研究发现用MSX-1免疫的小鼠，在抵抗M. tb感染方面，与用牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）BCG免疫的小鼠一样受到保护，且不会对结核菌素致敏。这些结果表明，功能性的M. tb ESX-1系统可以在耻垢分枝杆菌中组装，用以揭示分泌机制的新方面，并且改造的耻垢分枝杆菌菌株可以作为结核病（tuberculosis, TB）疫苗发挥作用。然而，与BCG不同，它的部署可能与当前用于诊断TB的检测方法相容。

IMPORTANCE

在本研究中，我们改造了常被用作分枝杆菌研究替代模型生物的耻垢分枝杆菌，使其产生并组装功能性的结核分枝杆菌（M. tb）ESX-1蛋白分泌系统。其中一个名为MSX-1的耻垢分枝杆菌菌株被证实能构建功能性的M. tb ESX-1系统而不会获得毒力。并且，通过使用耻垢分枝杆菌作为研究ESX-1系统的底盘，我们发现此前功能未知的M. tb基因rv3860是生产关键ESX-1蛋白所必需的。最后，用MSX-1免疫的小鼠与接种BCG（唯一获批的TB疫苗）的小鼠一样受到结核病（TB）的保护。值得注意的是，我们发现与BCG不同，MSX-1不会使小鼠对现有TB诊断测试中使用的抗原致敏。这些观察结果共同凸显了耻垢分枝杆菌作为研究M. tb ESX-1分泌机制底盘的实用性。

INTRODUCTION

结核分枝杆菌（M. tb）及其他结核病（TB）致病菌（M. tb复合群，MTBC成员）通过五种功能不同的VII型蛋白分泌系统形式——ESX-1至ESX-5——输出毒力效应蛋白。其中，ESX-1对MTBC的毒力和免疫致病性最为关键。基于结构研究，预测其由一个多亚基的跨膜易位子核心组成，该核心由EccB₁、EccCa₁、EccCb₁、EccD₁和EccE₁蛋白构成。这个易位子核心与其他ESX-1相关蛋白以能量依赖且协调的方式共同工作，以输出EspA、EspB、EspC、EsxA和EsxB等毒力效应因子，这些同时也是高度免疫显性的蛋白抗原。虽然EsxA、EsxB、EspA和EspC表现出相互共依赖的分泌，但EspB在MTBC中的分泌独立于这四种蛋白。MTBC ESX-1系统的另一个独特特征是，需要EspA、EspB、EspC、EsxA和EsxB的表达才能使整个分泌系统发挥功能。最后，虽然EspD也为ESX-1功能所必需，但其输出已被证明大部分是ESX-1非依赖性的。基于我们当前的理解，MTBC ESX-1系统的最小功能单元，包括易位子核心、相关伴侣蛋白、ATP酶和分泌的效应因子，全部由esx-1基因座（espE/rv3864至mycP₁/rv3883c）和远端共转录的espACD操纵子（espA/rv3616c, espC/rv3615c, espD/rv3614c）中的基因编码。尽管对MTBC ESX-1系统已有较多了解，但该系统的其他组件及其活性的调节因子仍有待鉴定。此外，对其时空结构和活性的理解也存在空白。填补这些空白的主要障碍包括MTBC中研究ESX-1系统所需的生长速度慢以及生物安全三级（BSL-3）设施的要求。

鉴于这些挑战，为了理解MTBC ESX-1系统的工作机制，研究人员研究了其他生物安全要求较低的分枝杆菌物种中的同源ESX-1系统。这些包括海分枝杆菌（Mycobacterium marinum）（一种在冷血脊椎动物中引起结核样疾病的快速生长病原体）和耻垢分枝杆菌（一种非致病性、快速生长的模型生物，在分枝杆菌研究中有着可靠的应用记录）的ESX-1系统。尽管获得了有价值的机制见解，但这些替代分枝杆菌的ESX-1系统与MTBC的ESX-1系统之间存在显著差异，必须加以考虑而不能外推到MTBC ESX-1。事实上，与MTBC不同，耻垢分枝杆菌利用其ESX-1系统进行接合DNA转移而非毒力。尽管存在这些差异，个别M. tb ESX-1蛋白编码基因已在耻垢分枝杆菌中表达，用于纯化和表征重组的M. tb ESX-1蛋白；而在其他研究中，构建了表达单个ESX-1蛋白（如EsxA和EsxB）以及ESX-1相关蛋白（如EspC）的重组耻垢分枝杆菌，并探究了它们与宿主的相互作用。

在本研究中，编码已知M. tb ESX-1系统蛋白的基因被转入广泛用于分枝杆菌研究的耻垢分枝杆菌mc²155菌株。因此，构建了含有仅M. tb esx-1基因座、仅espACD操纵子、或同时含有esx-1基因座和espACD操纵子的DNA的耻垢分枝杆菌菌株，并进行了表征。我们的发现强调了使用耻垢分枝杆菌作为研究M. tb ESX-1系统底盘的实用性。

MATERIALS AND METHODS

Enzymes and reagents

DNA修饰酶和高保真Phusion DNA聚合酶购自New England Biolabs（美国马萨诸塞州伊普斯维奇）。寡核苷酸购自Integrated DNA Technologies（美国爱荷华州科勒尔维尔）。使用的所有其他化学品和试剂均购自Sigma-Aldrich（加拿大安大略省奥克维尔）。

Bacterial strains and growth conditions

结核分枝杆菌（M. tuberculosis）Erdman菌株（M. tb）、牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）BCG Pasteur 1173P2（BCG）、耻垢分枝杆菌（M. smegmatis）mc²155以及重组耻垢分枝杆菌常规在添加了10% albumin-dextrose-catalase (ADC) 和0.05% Tween-80的Middlebrook 7H9液体培养基（完全7H9培养基）中培养，或在添加了10% oleic acid-albumin-dextrose-catalase (OADC) 的Middlebrook 7H11琼脂（完全7H11琼脂）上培养。此外，重组耻垢分枝杆菌在含有30 μg/mL卡那霉素（Kan; Sigma-Aldrich, Canada）和55 μg/mL潮霉素（Hyg; Roche, Canada）的条件下生长。

Construction of recombinant M. smegmatis strains

通过标准电穿孔程序转化DNA构建体获得重组耻垢分枝杆菌菌株。简要来说，首先用电穿孔感受态的耻垢分枝杆菌mc²155细胞与整合性粘粒2F9（其携带一段包含24个基因（rv3860至rv3885）的M. tb DNA片段，其中包括esx-1基因座）进行电穿孔，生成M. smegmatis::2F9。耻垢分枝杆菌mc²155也用空载的、整合性的、含Hyg抗性盒的粘粒载体pYUB412（2F9即基于此载体）进行电穿孔，生成M. smegmatis::pYUB412。两者均在含有Hyg的完全7H11琼脂上进行选择。此后，M. smegmatis::2F9和M. smegmatis::pYUB412用称为pMDespACD的附加体Kan抗性盒质粒（其含有M. tb espACD操纵子）进行转化，并在含有Hyg和Kan的完全7H11琼脂上进行选择。M. smegmatis::2F9和M. smegmatis::pYUB412也用pMDespACD所基于的空pMD31质粒进行转化，并在含有Hyg和Kan的完全7H11琼脂上进行选择。因此，生成了四种不同的重组耻垢分枝杆菌菌株：(i) M. smegmatis::pYUB412 + pMD31（野生型，含空载体），(ii) M. smegmatis::pYUB412 + pMDespACD（仅含espACD操纵子），(iii) M. smegmatis::2F9 + pMD31（仅含esx-1基因座），和(iv) M. smegmatis::2F9 + pMDespACD（含esx-1基因座和espACD操纵子），下文指定为MSX-1。

Construction of 2F9 Sbf1

在2F9粘粒中鉴定出两个Sbf1限制性位点。一个位点位于2F9的非编码区，另一个位于位于esx-1基因座DNA 5'端的rv3860基因内。用Sbf1-HF（NEB）进行限制性酶切，产生38.25 kb和1.2 kb的线性DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳分离。使用Monarch DNA凝胶提取试剂盒（NEB）纯化较大的DNA片段，并使用T4连接酶（NEB）重新连接，产生称为2F9 Sbf1的修饰粘粒。

Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analysis of esx-1 genes

将生长至对数生长晚期的M. smegmatis::2F9和M. smegmatis::2F9 Sbf1菌株离心沉淀并重悬于RLT缓冲液（Qiagen）。使用0.1 mm氧化锆珠子（BioSpec Products）裂解细胞，随后使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）提取总RNA，并按照Turbo DNA-free Kit protocol（Ambion）用Turbo DNase（Ambion）处理以去除任何污染的DNA。使用iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR Kit（Bio-Rad）从处理后的RNA合成cDNA。使用SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad）和基因特异性引物测量基因表达。基因诱导比率相对于MSMEG_2758（sigA）rRNA进行标准化，并使用ΔΔC_T方法分析结果。

M. smegmatis culture conditions and protein preparation for immunoblots

如先前所述培养分枝杆菌以获得用于分析的培养上清（culture filtrate, CF）和细胞裂解物（cell lysate, CL）蛋白，并稍作修改。简要来说，将重组耻垢分枝杆菌在含有Kan和Hyg的完全7H9培养基中培养至对数生长期中期，离心，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，并重悬于不含ADC和Tween-80的改良7H9（m7H9）培养基（但含有Kan和Hyg）中，起始OD_600nm为0.2，并在37°C振荡培养。然后在指定时间点取等分细胞培养物离心以获得培养上清和细菌沉淀。培养上清随后在具有5 kDa分子量截留膜的Vivaspin柱（Sartorius, Canada）中浓缩以获得CF。通过将细菌沉淀重悬于含有EDTA-free蛋白酶抑制剂混合物片剂（Roche, Canada）的PBS中，使用100 μm玻璃珠进行珠磨破碎，并通过离心澄清来制备CL。使用 bicinchoninic acid (BCA) 测定法（Thermo Fisher, Canada），以牛血清白蛋白作为标准，测定不同分枝杆菌菌株CF和CL中的总蛋白浓度。

Immunoblotting

如先前所述进行免疫印迹，并稍作修改。简要来说，将指定量的总CF和CL蛋白每道上样，在NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝胶（Thermo Fisher, Canada）中分离，并使用iBlot2系统（Thermo Fisher, Canada）转移至硝酸纤维素膜。膜用 tris buffered saline (TBS)-milk （20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl 和 5%脱脂奶粉）封闭，并在4°C与稀释于 tris buffered saline with tween-20 (TNT-BSA) （20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20 和 1% BSA fraction V）中的一抗孵育过夜。膜用TNT洗涤，与适当的荧光二抗在TNT-BSA中孵育，用TNT洗涤三次，并使用Odyssey CLx成像系统（Li-Cor Biosciences, Canada）扫描。GroEL2用作CF的裂解对照和CL的上样对照。ESX-1非依赖性分泌蛋白Ag85作为CF的上样对照进行探测。本实验室由Eurogentec S.A.生产的针对EspB和EspD的大鼠多克隆抗体以1:1,000稀释度使用。商业化的抗EsxA小鼠单克隆抗体（Abcam）、抗EsxB兔多克隆抗体（BEI Resources）、抗GroEL2小鼠单克隆抗体（BEI Resources）和抗Ag85兔多克隆抗体（BEI Resources）均以1:2,000稀释度使用。

In vitro growth measurement of recombinant M. smegmatis strains

将每种重组耻垢分枝杆菌菌株接种到含有Kan和Hyg的7H9完全培养基的烧瓶中，起始OD_600nm为0.2，并在37°C振荡培养。在不同指定时间点取等分试样进行OD_600nm测量。至少进行了两次独立的生长实验。

THP-1 assays

如先前所述培养人THP-1单核细胞（TIB-202, ATCC），使用佛波酯（PMA）分化为巨噬细胞样细胞，并接种于96孔组织培养板中。用于THP-1感染的重组耻垢分枝杆菌菌株在含有Kan和Hyg的7H9完全培养基中培养。测量OD_600nm并计算每毫升菌落形成单位（CFU/mL）后，将分枝杆菌等分试样加入补充了10%胎牛血清的RPMI培养基中，以获得所需CFU/mL，达到预期的感染复数（MOI）。

为了量化巨噬细胞中诱导的细胞毒性，将悬浮于RPMI中的分枝杆菌以MOI为1感染96孔板中的THP-1细胞。感染后12小时，使用PrestoBlue试剂（Thermo Fisher, Canada）量化THP-1细胞的存活率，如先前所述。

为了确定不同分枝杆菌在THP-1细胞内的复制情况，将悬浮于RPMI中的分枝杆菌以MOI为0.25感染24孔板中的THP-1细胞。2小时后，将感染细胞每孔中的培养基更换为含有10 μg/mL庆大霉素的新鲜完全RPMI。在感染后的不同时间点（2小时、10小时、24小时和48小时），洗涤相应孔中的细胞一次，然后用含有0.1% Triton X-100的PBS裂解。将得到的THP-1细胞裂解物进行系列稀释，并涂布在补充了OADC以及Kan和Hyg的7H10培养基上，以回收分枝杆菌进行CFU计数。

Protective efficacy trial in the mouse model of TB

将六周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为五组，每组八只，每组小鼠皮下接种一次1 × 10⁶ CFU/只的M. smegmatis::pYUB412 + pMD31、M. smegmatis::2F9 + pMD31、MSX-1、牛分枝杆菌BCG Pasteur 1173P2或生理盐水。接种后三周，处死每个疫苗组的两只动物，收集脾脏用于脾细胞试验，以测量牛分枝杆菌抗原特异性T细胞介导的干扰素-γ（IFN-γ）产生（见下文程序）。剩余的小鼠然后通过鼻内途径用1 × 10³ CFU/只的强毒M. tb Erdman进行攻击，每日监测，并在28天后实施安乐死。收集所有动物的脾脏和肺，匀浆，并涂布在完全7H11琼脂上，以计数这些器官中的M. tb负荷（每组四只小鼠）并进行组织病理学分析（每组两只小鼠）。

Splenocyte assay

该试验如先前所述进行。简要来说，将从不同组疫苗接种小鼠收集的脾脏捣碎，分离出的脾细胞在96孔板中以1 × 10⁶细胞/孔培养，设复孔。来自每个疫苗接种组每只小鼠的脾细胞与RPMI组织培养基、5 μg/mL纯化蛋白衍生物（PPD）（牛结核菌素PPD 3000, Prionics Lelystad B.V.）、5 μg/mL牛分枝杆菌BCG Pasteur CF（内部制备）和1 μg/mL刀豆蛋白A或ConA（Sigma-Aldrich, Canada）在37°C和5% CO₂下孵育72小时。使用Invitrogen IFN-γ小鼠ELISA试剂盒（Thermo Fisher, Canada）按照制造商的说明定量脾细胞培养上清中的IFN-γ。

Histopathology

来自不同疫苗接种组小鼠的肺组织样本在10%正常缓冲福尔马林中固定约1周，石蜡包埋，切片用苏木精和伊红（H & E）染色，以评估炎症情况，如先前所述。

Statistical analysis

使用GraphPad Prism绘制定量数据并进行指定的统计分析。使用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey多重比较分析M. smegmatis在THP-1巨噬细胞中引起的细胞毒性差异。使用双因素方差分析（two-way ANOVA）和Tukey多重比较分析M. smegmatis在THP-1巨噬细胞中细胞内负荷的差异。使用Student's t检验（双尾、非配对、参数检验）分析RT-qPCR实验中的转录差异。

RESULTS

M. smegmatis transformed with genes of the M. tb esx-1 locus and espACD operon expresses an optimally functioning M. tb ESX-1 system

用含有M. tb基因组DNA片段（包含esx-1基因座）的整合性粘粒2F9、附加体pMDespACD质粒（其含有由其自身启动子控制的espACD操纵子）以及相应的空载体pYUB412和pMD31转化耻垢分枝杆菌mc²155，生成M. smegmatis::pYUB412 + pMD31（野生型）、M. smegmatis::pYUB412 + pMDespACD、M. smegmatis::2F9 + pMD31和M. smegmatis::2F9 + pMDespACD（指定为MSX-1）。通常，MTBC分泌组分析使用该生物在Sauton's培养基（一种化学定义的液体培养基）中生长的培养上清进行。然而，据报道，具有同源ESX-1系统但无同源espACD操纵子的耻垢分枝杆菌，能在Sauton's培养基中输出其自身的ESX-1蛋白底物，但在缺乏ADC和Tween-80的改良7H9液体培养基中则不能。因此，为了区分M. tb和耻垢分枝杆菌ESX-1分泌的蛋白，我们在重组耻垢分枝杆菌于缺乏ADC和Tween-80的改良7H9液体培养基中生长的蛋白组分上进行了免疫印迹分析。相应地，使用对这些蛋白特异的抗体，在M. smegmatis::pYUB412 + pMD31或M. smegmatis::pYUB412 + pMDespACD的5 μg CF和2.5 μg CL蛋白组分中未检测到M. tb EsxA和EsxB。并且，虽然在M. smegmatis::2F9 + pMD31和M. smegmatis::2F9 + pMDespACD（或MSX-1）的CF和CL组分中都检测到了M. tb EsxA和EsxB，但它们在MSX-1的CF和CL组分中的信号更强。同样，使用对M. tb EspB特异的抗体，该蛋白仅在M. smegmatis::2F9 + pMD31和MSX-1的CF和CL组分中检测到，尽管后者的信号更强。虽然在M. smegmatis::pYUB412 + pMDespACD的CL组分中检测到M. tb EspD，但该蛋白在MSX-1 CL组分中的量明显更高。此外，EspD仅在培养20和30小时后才在MSX-1的CF组分中检测到。对更高量CF（15 μg/孔）和CL（7.5 μg/孔）蛋白进行SDS-PAGE分离和免疫印迹证实，观察到的ESX-1相关蛋白水平的差异是可重复的。

上述CF组分中EspB、EspD、EsxA和EsxB水平的差异并非由于总CF蛋白上样量不均所致，因为ESX-1非依赖性分泌蛋白Ag85的信号在所有菌株相应时间点的CF组分中相似。同样，上述CL组分中EspB、EspD、EsxA和EsxB丰度的差异可能也不是由于总CL蛋白上样不均所致，因为细胞相关伴侣蛋白GroEL2和Ag85的信号在所有四个菌株相应时间点的CL组分中相似。所有四个菌株CF组分中均无GroEL2，表明某些菌株中EsxA、EsxB、EspB和EspD的存在并非由于细胞自溶。

M. smegmatis producing the M. tb ESX-1 system grow at similar rates

为了确定生长速率差异是否可能是不同耻垢分枝杆菌菌株ESX-1蛋白表达和分泌可变的原因，我们比较了M. smegmatis::pYUB412 + pMD31、M. smegmatis::pYUB412 + pMDespACD、M. smegmatis::2F9 + pMD31和MSX-1在补充了Kan和Hyg的7H9培养基中的生长情况。观察到所有四种重组耻垢分枝杆菌菌株在该液体培养基中以相同的速率生长。

M. smegmatis producing M. tb ESX-1 is non-virulent in the macrophage model of infection

野生型耻垢分枝杆菌对哺乳动物细胞无致病性且无细胞毒性。然而，由于ESX-1系统对M. tb毒力至关重要，并且ESX-1介导的EsxA、EsxB、EspA、EspB和EspC的输出是M. tb诱导巨噬细胞死亡所必需的，我们想知道表达M. tb ESX-1的耻垢分枝杆菌菌株是否可能对巨噬细胞具有细胞毒性。因此，将人THP-1巨噬细胞与M. smegmatis::pYUB412 + pMD31、M. smegmatis::2F9 + pMD31、MSX-1共培养，或不做处理，并在12小时后评估巨噬细胞的活力。与未感染的THP-1细胞相比，未观察到任何感染重组耻垢分枝杆菌菌株的细胞显示活力降低。

鉴于M. tb需要完全功能的ESX-1系统才能在巨噬细胞内复制，而野生型耻垢分枝杆菌在被巨噬细胞摄取后无法复制并最终被清除，我们检查了重组耻垢分枝杆菌菌株在THP-1细胞中的命运。为此，将M. smegmatis::pYUB412 + pMD31、M. smegmatis::2F9 + pMD31和MSX-1分别与THP-1细胞共培养，并在不同时间点回收和量化细胞内分枝杆菌。共培养2小时后，观察到THP-1细胞摄取的M. smegmatis::pYUB412 + pMD31、M. smegmatis::2F9 + pMD31和MSX-1的数量没有差异。相对于感染后2小时的细胞内分枝杆菌数量，感染后10、24和48小时，细胞内M. smegmatis::pYUB412 + pMD31、M. smegmatis::2F9 + pMD31和MSX-1的数量均以相似的程度减少。

为了确定MSX-1缺乏细胞毒性和未增强的细胞内持久性是否可能由于其在THP-1细胞中丢失了附加体pMDespACD，我们评估了MSX-1在有和没有Kan的培养基中随时间增长的EspD表达，以此作为衡量pMDespACD维持情况的一种方式。事实上，在无Kan条件下培养长达8天的MSX-1中的EspD水平与在相同时间内有抗生素条件下培养的同一菌株中所见水平相当。这强烈表明该质粒构建体得以维持，并且在撤除Kan选择压力后不会被MSX-1迅速丢失。因此，pMDespACD的丢失可能不是其细胞毒性和细胞内持久性在巨噬细胞中未改变的根本机制。

M. smegmatis transformed with a modified 2F9 cosmid reveals rv3860 to be associated with the transcriptional activation of pe35, ppe68, esxB, and esxA

我们接下来试图将espACD操纵子亚克隆到整合性2F9粘粒中，以便随后转化到耻垢分枝杆菌中，从而省去必须使用Kan选择附加体质粒的步骤。相应地，在2F9中鉴定出两个独特的Sbf1限制性