哥伦比亚2021-2022年临床样本中百日咳鲍特菌与SARS-CoV-2共感染的低阳性率分析及其流行病学意义

本综述系统分析了哥伦比亚2021-2022年间SARS-CoV-2阳性样本中百日咳鲍特菌（Bordetella spp.）的共感染情况，发现共感染率仅为0.54%（6/1102），其中B. pertussis和B. parapertussis分别占4例和2例。研究强调非药物干预措施（NPIs）、鲍特菌的周期性流行规律及样本地理局限性对结果的影响，为拉丁美洲地区呼吸道病原体共感染研究提供了首份基线数据。

　　

ABSTRACT

百日咳（Pertussis）和COVID-19是具有相似临床表现的呼吸道疾病，为临床诊断带来挑战。哥伦比亚的百日咳监测体系基于通过实验室检测确诊的疑似病例。在COVID-19大流行期间，百日咳的发病率显著下降。鉴于关于COVID-19与百日咳共感染的数据有限，本研究旨在评估2021年至2022年期间哥伦比亚收集的SARS-CoV-2阳性样本中鲍特菌属（Bordetella spp.）的阳性率。研究采用简单随机抽样方法，从国家参考实验室（NRL）储存的样本中选取了1102份样本进行回顾性分析。通过国家监测系统（SIVIGILA）获取人口统计学数据、症状、并发症和种族信息，并利用PCR结果鉴定鲍特菌属共感染。采用Clopper-Pearson置信区间估计全国及省级阳性率。PCR检测结果显示，0.54%（6/1102）的样本呈鲍特菌属阳性，其中4例为百日咳鲍特菌（B. pertussis），2例为副百日咳鲍特菌（B. parapertussis），未检出霍氏鲍特菌（B. holmesii）共感染。2021年全国SARS-CoV-2与鲍特菌属共感染阳性率为1.92%，2022年降至1.25%。尽管病毒病原体与百日咳鲍特菌的共感染较为常见，但本研究发现2021-2022年期间哥伦比亚SARS-CoV-2与鲍特菌属共感染阳性率较低，这可能与非药物干预措施、百日咳鲍特菌的周期性流行模式以及样本地理和人口覆盖范围的局限性导致的低估有关。这是哥伦比亚首份此类共感染报告，为拉丁美洲未来的研究提供了参考。

IMPORTANCE

这是哥伦比亚首份SARS-CoV-2与鲍特菌属共感染的报告，为2021-2022年期间其低发生率提供了关键证据。鉴于两种疾病具有相似的临床特征且可能使鉴别诊断复杂化，这些发现强调了呼吸道病原体整合监测的重要性。观察到的阳性率下降可能与非药物干预措施和百日咳的周期性有关，同时也凸显了样本地理和人口代表性的潜在局限性。本研究为拉丁美洲未来的研究提供了有价值的基线，并强化了在流行病或大流行背景下检测共感染（尤其是强化诊断能力）的必要性。

INTRODUCTION

百日咳是一种由百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis）引起的疫苗可预防的高度传染性呼吸道疾病。自1978年起，哥伦比亚已将白喉、破伤风和百日咳疫苗纳入扩大免疫规划（EPI），规定5岁以下儿童必须接种。当前免疫程序包括：在2、4、6月龄时接种五联疫苗（白喉、百日咳、破伤风、乙型肝炎和b型流感嗜血杆菌Hib），后在18月龄和5岁时各接种1剂百白破（DPT）加强疫苗。此外，自2014年起，在妊娠第三季度接种1剂破伤风、白喉、无细胞百日咳（Tdap）加强疫苗。2021年和2022年，哥伦比亚的DTP3疫苗覆盖率分别为86.5%和86.96%。百日咳的临床表现通常包括 prolonged cough，伴阵发性咳嗽、咳后呕吐、呼吸暂停或发绀。症状范围从相对轻微的咳嗽到严重的呼吸道疾病及并发症，如肺炎、惊厥、脑病、呼吸衰竭和死亡。虽然百日咳主要由百日咳鲍特菌引起，但其他物种如副百日咳鲍特菌（Bordetella parapertussis）和霍氏鲍特菌（Bordetella holmesii）也可引起人类较轻的呼吸道感染，表现为类百日咳综合征。百日咳和COVID-19是具有重叠临床表现的呼吸道疾病，使得鉴别诊断具有挑战性。自1997年起，哥伦比亚的百日咳监测已成为整合风险分析、病例报告和实验室确认的流行病学监测的一部分。百日咳病例由公立和私立医疗机构报告至国家监测系统（SIVIGILA），同时由国家参考实验室（NRL）的微生物学组和经过培训的网络实验室进行百日咳鲍特菌的实验室确认。COVID-19大流行期间实施的严格非药物干预措施通过减少病毒传播保护了人群，尤其是儿童和老年人。然而，其他呼吸道病原体的发病率也显著下降，包括百日咳鲍特菌。全球百日咳发病率在COVID-19大流行期间显著下降，从2019年的每百万人口23例降至2020年的9.9例和2021年的4.6例。然而，大流行后，百日咳病例在2023年出现上升，达到每百万人口23.6例。这一增长在欧洲地区尤为明显，同期发病率从每百万人口23.7例升至104例。同样，西太平洋地区的病例从每百万人口6.1例增至26.4例，凸显了因患者并发症、共感染和死亡病例风险而需加强流行病学监测的必要性。在此背景下，哥伦比亚实验室确诊的百日咳病例数显著减少。与2019年（n = 302）相比，2021年确诊病例数下降91.72%（n = 25），2022年下降86.75%（n = 40）。作为国家应对大流行和公共卫生监测重点转移的一部分，哥伦比亚国家卫生研究院（INS）承担了协调这些工作的领导职责。在此期间，SARS-CoV-2样本在国家病毒学参考实验室和一些网络内的省级公共卫生实验室（DPHL）进行处理和储存。目前，实验室仍保留在此期间储存的SARS-CoV-2阳性样本，这为研究提供了宝贵资源。本研究的 relevance 在于COVID-19大流行背景，期间SARS-CoV-2的高传播性凸显了呼吸道病原体的传播动态。在此情景下，考虑到该期间观察到的百日咳报告病例显著下降，研究百日咳鲍特菌的传播被认为具有重要意义。关于病毒病原体与百日咳鲍特菌共感染的研究较为常见，报告的共感染率高达69.7%，但鉴于关于COVID-19与百日咳共感染的国内外数据有限，且具有相关样本可用性，本研究旨在评估2021-2022年期间哥伦比亚INS实验室监测中SARS-CoV-2阳性样本中鲍特菌属共感染的阳性率。

MATERIALS AND METHODS

Sample selection

从可用样本（n = 12881）中，通过简单随机抽样选取1102份样本（占8.6%）。分析的鼻咽样本为2021年1月至2022年12月期间经实时逆转录PCR（RT-PCR）确认为SARS-CoV-2阳性的样本。所有样本均在NRL的微生物学组进行分析。

Molecular testing

所有样本在分析前储存于-80°C。使用MagMAX Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit（Thermo Fisher Scientific, USA）在KingFisher Flex系统（Thermo Fisher Scientific, USA）上通过自动化方法从200 μL鼻咽样本中提取细菌核酸。为检测鲍特菌物种，进行了双重实时PCR（qPCR）检测。使用多靶点实时PCR（qPCR） assay 鉴定插入序列IS481、pIS1001和hIS1001，同时采用qPCR assay 检测人内参RNase P，随后进行针对ptxS1的 confirmatory singleplex assay。PCR算法解读见图1。当循环阈值（CT值）≥40时，PCR结果视为阴性。

Data collection

通过将SIVIGILA记录的变量与实验室数据库进行交叉引用，获取所分析样本的社会人口学、流行病学和临床数据。来自SIVIGILA和病毒学组的记录经过匿名化处理，并保护健康信息（PHI），确保其管理和分析的安全性与保密性。

Data analysis

对有和无共感染患者的社会人口学特征、症状和实验室数据进行了描述性和双变量分析。为比较仅感染SARS-CoV-2的患者与共感染患者临床症状持续时间的平均值，进行了单因素方差分析（ANOVA）。数据使用Epi Info 7和Microsoft Excel软件进行分析，P值<0.05被认为具有统计学显著性。为计算阳性率，将确定的COVID-19与百日咳共感染病例数作为分子，将检测百日咳鲍特菌的COVID-19阳性样本数作为分母。阳性率通过乘以100的系数以百分比表示。此方法既用于估计年度阳性率（2021-2022年），也用于按检测到共感染的省份进行分层分析。为估计共感染率，采用精确的Clopper-Pearson方法计算二项比例的置信区间。选择此方法是因为其在样本量较小或观察比例接近0或1时能提供准确的区间估计。置信区间使用OpenEpi软件计算。

RESULTS

在所有SARS-CoV-2阳性样本中，53.45%为女性。所有患者中，50.72%报告咳嗽为COVID-19的最常见症状。无百日咳症状记录。所有患者年龄范围从<1岁至80岁，但最具代表性的年龄组（77.58%）为20至69岁。在分析的样本中，6份（0.54%）检测出鲍特菌属阳性。其中，4份（66.67%）与百日咳鲍特菌共感染，2份（33.33%）与副百日咳鲍特菌共感染。在这些共感染中，16.66%（1/6）为印第安人，33.3%（2/6）为黑人种族。这些共感染患者的年龄范围从20岁到70岁，但共感染数量最高的是20-29岁年龄组。共感染患者与仅患COVID-19的患者在疲劳 prevalence 上观察到显著差异（P < 0.05），75%的共感染患者报告疲劳，而仅16.51%的仅COVID-19患者出现此症状。表1详细列出了有和无共感染的SARS-CoV-2患者登记的其他症状。在仅感染SARS-CoV-2的患者（x? = 5.84 ± 23.63）与2021年共感染患者（x? = 8.16 ± 5.42）的临床症状平均持续时间上观察到显著差异（P < 0.05）。此外，共感染患者中无死亡或住院病例。

Positivity of coinfections

2021年SARS-CoV-2与鲍特菌属共感染阳性率为0.75%（4例），2022年为0.34%（2例）。两年中，共感染估计阳性率均未超过2.0%（表2）。2021年，共感染在Chocó、Norte de Santander和Guaviare省得到确认。最高阳性率出现在Guaviare，为5.26%（1/19）。Chocó和Guaviare省的两种疾病共感染估计阳性率超过1.0%（表3）。2022年，共感染在Magdalena和Amazonas两个省被识别。最高阳性率出现在Magdalena，为10.0%（1/10）。Amazonas的共感染估计为1.09%（1/91）（表3）。

DISCUSSION

本研究在哥伦比亚2021-2022年期间的SARS-CoV-2患者中识别出实验室确认的鲍特菌属共感染。我们的发现与另一项研究一致，该研究也报告了SARS-CoV-2/鲍特菌属共感染的低比例（0.78%）。尽管识别的共感染数量较少，但这一趋势是预期的，原因在于大流行期间采取的非药物措施，如社会隔离、口罩使用和卫生意识提高， contributed to 百日咳发病率的下降。这一减少将限制共感染的机会，即使SARS-CoV-2广泛传播。研究识别出的共感染不仅涉及百日咳鲍特菌，还包括副百日咳鲍特菌。虽然副百日咳鲍特菌不是死亡的主要原因，但已有与百日咳疫情无关的散发 cases 报告。值得注意的是，白喉-破伤风-百日咳（DTP）疫苗不能提供针对副百日咳鲍特菌的有效保护，且一些病例表现为类百日咳症状。鉴于此，对具有 whooping cough 症状的患者同时检测百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌至关重要。响应这一需求，微生物学组自2014年起一直使用qPCR监测副百日咳鲍特菌。尽管如此，本研究所分析样本中患者的疫苗接种史不可用。然而，91.29%的人口年龄超过10岁，可能因百日咳疫苗 immunity waning 而缺乏保护。在哥伦比亚，SARS-CoV-2与鲍特菌属共感染的唯一 documented 报告由INS审查。2020年，确认了4例百日咳与COVID-19共感染病例，其中50%（2/4）影响1岁以下儿童。主要症状为咳嗽和阵发性咳嗽，平均持续11天，而25%（1/4）出现肺炎等并发症。我们的结果表明，与仅感染SARS-CoV-2的患者相比，共感染患者表现出更多的临床表现，如疲劳。2021年，INS通报了4例可能涉及百日咳鲍特菌与其他呼吸道病毒的共感染（4/75），其中1例为与SARS-CoV-2的共感染（1/75）。该共感染发生在Choco省，当地一场大规模百日咳疫情影响了一个 indigenous community。2022年，在Sierra Nevada de Santa Marta的 indigenous population 中报告了类似疫情。我们的发现表明，SARS-CoV-2共感染患者更常为印第安人或与印第安社区有流行病学联系。这些人群特别 vulnerable，因为许多未加入社会健康保障体系且 often lack complete vaccination schedules。在哥伦比亚，百日咳主要影响印第安和农村社区。然而，需要强调的是，本研究分析的样本来自城市人口，这可能部分解释了观察到的低共感染率。此外，在Guaviare和Amazonas省识别出鲍特菌属共感染。然而，这些地区报告的百日咳病例数非常低，表明存在流行病学 silence surveillance system。共感染更常见于年轻成年患者。在Roh等人的研究中，报告了SARS-CoV-2与细菌共感染患者的中位年龄为32.0 ± 6.0岁，暗示年轻人可能更容易感染呼吸道病原体共感染。一些仅感染SARS-CoV-2的患者在2021年报告了异常 prolonged 症状持续时间。这表明他们可能与其他呼吸道病原体共感染。Chen等人总结了与SARS-CoV-2最常见的微生物共感染，突出了呼吸道病毒如冠状病毒（非COVID-19）（2.1%）、肠道病毒/鼻病毒（hRV）（6.9%）、甲型流感病毒（4.57%）、人偏肺病毒（hMPV）（1.98%）和呼吸道合胞病毒（RSV）（3.46%）。细菌共感染占4.97%，包括鲍曼不动杆菌、放线菌属和肺炎克雷伯菌。真菌共感染见于3.16%的病例，涉及军团菌、罗氏菌属、链球菌属、韦荣球菌属、曲霉属和念珠菌属。另一方面， several studies 报告了百日咳患者与其他呼吸道病毒的共感染。Ferronato等人在7%的病例中识别出共感染，其中4.9% specifically 涉及呼吸道合胞病毒（RSV）。Scutari等人发现了 high coinfection rate（69.76%）与呼吸道病毒，包括人鼻病毒/肠道病毒（7/43）、hMPV（3/43）、副流感病毒3型（PIV3）（1/43）、冠状病毒OC43（1/43）和RSV（1/43）等。此外，INS documented 了2024年发生在Antioquia的Urrao和Betulia印第安人群中的百日咳疫情，确认了12例病例。其中，识别出与其他呼吸道病原体的共感染，包括甲型流感（H3）（25%）、腺病毒（66.6%）和RSV（58.33%）。这一发现强化了百日咳与各种呼吸道病原体之间存在潜在相互作用的假设，并强调了此类相互作用在不同地理区域和人群背景下的发生。在美洲，2020年至2023年间百日咳发病率显著下降，从每百万人口20.1例降至6.1例。这一减少主要源于监测工作重新定向于SARS-CoV-2，暂时影响了百日咳鲍特菌病例的检测和报告。然而，截至2024年，发病率正在稳定并回归大流行前水平，反映了对百日咳监测的重新关注及其自然流行病学趋势。 several countries，包括美国、墨西哥、秘鲁和巴西，正在经历 resurgence，表明百日咳鲍特菌的传播在分析期间较低但正在重新建立。在哥伦比亚，此期间观察到的较低共感染率也可归因于百日咳鲍特菌的自然周期性行为，其遵循4年的病例数波动模式。此外，为减缓SARS-CoV-2传播实施的保护措施，如戴口罩、社交距离和限制流动，可能 contributed to 减少百日咳鲍特菌和其他呼吸道病原体的传播。本研究也存在一些局限性。首先，来自Antioquia、Bogotá D.C.和Cundinamarca省的样本 inclusion 较低，这些省报告了最高数量的百日咳病例。这可能影响了我们发现的省级代表性。其次，缺乏症状或医疗记录信息以在分析中关联百日咳症状。这些结果作为研究COVID-19与百日咳共感染的参考框架，是拉丁美洲的首份报告，并首次在哥伦比亚确认了SARS-CoV-2与百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌的共感染。通过研究或症候群监测进行更深入的 follow-up 对于检测多种病原体和更好理解共感染动态至关重要。这一方法将有助于识别最受影响的人群并评估潜在的公共卫生影响。此类监测的需求尤其与5岁以下儿童和60岁以上成年人相关，他们更容易出现严重并发症。由于其发育中或衰老的免疫系统，这些人群面临较高 adverse outcomes 风险，突出了 addressing 其特定需求的 tailored 预防和治疗策略的重要性。

ACKNOWLEDGMENTS

本研究由泛美卫生组织/世界卫生组织和INS微生物学组资助。我们感谢Mirta Magari?os博士担任泛美卫生组织（PAHO）COVID-19与百日咳共感染拉丁美洲研究的焦点人物。我们感谢PAHO/世界卫生组织（WHO）对COVID-19与百日咳共感染拉丁美洲研究的倡议和资助贡献。我们感谢美国疾病控制与预防中心百日咳和白喉实验室（亚特兰大，佐治亚州，美国）的技术建议，特别是美国卫生与公众服务部的Lucia Pawloski、Marissa Fraire、Ingrid C. McCall和Tami H. Skoff。我们感谢Valle和Risaralda省级公共卫生实验室提供其实验室储存的SARS-CoV-2样本。我们感谢美国疾病控制与预防中心百日咳和白喉实验室（亚特兰大，佐治亚州，美国）的技术建议，特别是美国卫生与公众服务部的Lucia Pawloski、Marissa Fraire、Ingrid C. McCall和Tami H. Skoff。