血红素依赖性膜定位环氧化物异构酶的功能表征与催化机制解析——以红球菌和扎瓦尔津氏菌为例

本综述聚焦于苯乙烯氧化物异构酶（SOI）的功能表征与膜定位机制，通过融合蛋白技术（SUMO/sfGFP/mCherry）实现异源过表达，结合定点突变（如H57A/R111A）、荧光显微镜定位及EPR光谱分析，揭示了SOI依赖血红素辅因子（heme）的路易斯酸催化机制（His-57为轴向配体），并证实其C端延伸区对底物通道（substrate channeling）和膜锚定功能的关键作用，为芳烃降解途径的酶工程改造提供新视角。

　　

ABSTRACT

苯乙烯氧化物异构酶（SOI）是苯乙烯降解酶复合体的关键组分，负责将毒性中间体苯乙烯氧化物异构化为苯乙醛。本研究针对^{Rhodococcus opacus 1CP（RoSOI1）和Zavarzinia compransoris Z-1155（ZcSOI）的SOI酶，通过sfGFP标记融合技术证实其定位于E. coli细胞膜。定点突变揭示组氨酸-57（His-57）是血红素的轴向配体，而精氨酸-111（Arg-111）可能通过与血红素丙酸基团配位稳定辅因子。EPR谱学和生物催化实验进一步验证了血红素存在多种配位环境。末端延伸区的截断实验表明，N/C端结构域可能参与底物通道调控及酶复合体膜锚定功能。}

INTRODUCTION

苯乙烯是化工行业核心原料，年均产量达百万吨级，广泛用于聚苯乙烯合成。微生物通过侧链加氧途径降解苯乙烯：苯乙烯单加氧酶（SMO）催化生成苯乙烯氧化物，SOI将其异构为苯乙醛，最终由苯乙醛脱氢酶（PAD）氧化为苯乙酸。SOI长期被认为无需辅因子，通过酸-碱催化机制实现Meinwald重排反应。近期研究发现Pseudomonas sp. VLB120来源的SOI含有血红素，但其膜定位假说缺乏实验证据。本研究选取具有末端延伸的RoSOI1和ZcSOI，通过融合标签策略探究其催化机制、膜拓扑及结构-功能关系。

Alphafold3-based SOI model prediction

AlphaFold3预测的RoSOI1模型（含血红素配体）在跨膜区置信度评分（plDDT >70），末端和环区灵活性较高（plDDT 50–70）。该模型与PtSOI冷冻电镜结构（PDB: 8PNV）的Cα叠加均方根偏差（r.m.s.d）为0.65 ?（152个残基），验证了模型可靠性。结构显示SOI为三聚体膜蛋白，N/C端均朝向胞质侧，活性位点隧道邻近末端延伸区（图1）。

Site-directed mutagenesis of highly conserved charged amino acids

通过SUMO/sfGFP/mCherry融合标签实现SOI异源表达，全细胞催化实验（以茚氧化物为底物）证实所有构建体均保留活性（图2）。选择SUMO标签进行定点突变，针对保守酸性/碱性残基（E51、H57、K82、D94、R111）进行丙氨酸替换。H57A和H57C突变体完全丧失活性及血红素结合能力（图4），Western blot和血红素染色验证表达及辅因子加载（图S1–S4）。膜组分活性实验显示R111A突变体血红素保留但活性显著降低，UV/VIS谱显示其蛋白-血红素比值低于野生型（图5）。EPR谱揭示野生型存在两种低自旋信号（LS1/LS2）和一种高自旋信号（HS），其中LS2（g_z=2.97）可被连二亚硫酸钠还原，而R111A突变体仅保留LS2信号（图6），表明Arg-111通过稳定血红素丙酸基团影响配位环境。

Fluorescence microscopy of sfGFP-tagged SOI

sfGFP-C端融合的SOI在荧光显微镜下显示膜定位信号（图7a–f），而N端融合因游离sfGFP积累导致胞质弥散信号（图7g）。ZcSOI同样呈现膜定位特征（图7h），证实SOI为膜结合酶且两端胞质取向。活性分析表明：N端标签构建体（如SUMO-/sfGFP-RoSOI1）催化速率（k_obs ~8 s^?1）与野生型相当，而C端标签（尤其含柔性 linker）活性降低10倍（表1）。刚性sfGFP融合部分保留活性，提示C端延伸可能调控底物隧道构象。

Truncation of terminal extensions in SOIs

多序列比对显示SOI普遍存在末端延伸（图S8）。截断实验表明：RoSOI1的C端11残基截断（C164–167/C161–167/C157–167）导致活性降低但仍保留血红素；ZcSOI的N端26残基截断中，N1–21和N1–32完全失活，而N1–14活性提高2.5倍（图9）。所有截断体均定位于膜且保留血红素（图S9），证实末端延伸非信号肽，而是参与底物通道或酶-酶互作。

DISCUSSION AND CONCLUSION

本研究通过多技术联用揭示了SOI的血红素依赖性催化机制：His-57为轴向配体，Arg-111稳定辅因子结合。荧光显微镜明确其膜定位及胞质取向。末端延伸区截断实验表明C端调控底物通道（类似碳水化合物酯酶的隧道门控机制），N端影响催化效率。SOI可能作为苯乙烯降解途径的膜锚定平台，介导酶复合体组装。未来需进一步验证其与SMO/PAD的生理互作，为芳烃生物降解的工程应用提供理论基础。