新生儿缺氧缺血性脑损伤中褪黑素通过靶向NCX1抑制PINK1-Parkin通路介导的线粒体自噬发挥神经保护作用

本研究针对新生儿缺氧缺血性脑白质损伤这一临床难题，揭示了褪黑素通过调控钠钙交换体1（NCX1）动态表达，抑制PINK1-Parkin通路介导的过度线粒体自噬的新机制。研究人员通过建立新生大鼠模型，结合电生理、分子生物学和超微结构分析，证实褪黑素能显著改善神经元超兴奋性、促进髓鞘修复并提升长期认知功能，为临床治疗提供了重要的实验依据和潜在治疗策略。

　　

在围产期医学领域，新生儿缺氧缺血性脑病（Hypoxic-ischaemic encephalopathy, HIE）始终是导致新生儿死亡和长期神经系统后遗症的严重疾病。尤其对于早产儿而言，缺氧缺血（HI）引发的脑白质损伤（White matter damage, WMD）更是造成脑瘫、智力障碍和癫痫等终身残疾的主要病因。尽管近年来新生儿重症监护技术取得了显著进步，但极早产儿（胎龄26-29周）的死亡率仍高达40%-60%，幸存者中超过半数面临严重神经发育障碍的风险。当前临床实践中，针对HI-induced WMD的早期干预策略仍缺乏针对病理生理机制的循证方案，这凸显了开发具有年龄适用性和机制特异性的治疗方法的紧迫性。

褪黑素（Melatonin），作为一种内源性吲哚胺激素，因其卓越的穿透血脑屏障能力、强大的抗氧化特性以及抗炎、抗凋亡等多重生物学功能，近年来成为新生儿神经保护研究的热点。既往研究表明，褪黑素能够通过清除活性氧（ROS）、稳定线粒体膜电位、抑制炎症小体激活等途径减轻脑损伤。然而，关于褪黑素是否以及如何通过调节线粒体质量控制，特别是线粒体自噬（mitophagy）来发挥神经保护作用，尤其是其在发育中的大脑中对离子稳态和神经元兴奋性的影响，尚未有明确阐述。

本研究旨在深入探讨褪黑素在新生儿HI-induced WMD模型中的神经保护机制，特别聚焦于线粒体钠钙交换体1（NCX1）的动态表达及其对PINK1-Parkin通路介导的线粒体自噬的调控作用。研究人员假设，HI损伤会破坏NCX1的正常功能，导致细胞内钙超载，进而触发过度的线粒体自噬，最终导致神经元功能障碍和髓鞘损伤。而褪黑素干预则可能通过稳定NCX1的表达，抑制这一恶性循环，从而发挥保护作用。

为了验证这一假设，研究团队采用了 postnatal day 3 (P3) 的Sprague-Dawley (SD) 大鼠构建了HI-induced WMD模型。主要技术方法包括：通过颈总动脉结扎结合缺氧（8% O₂）2.5小时建立动物模型；使用蛋白质免疫印迹（Wes system）定量分析NCX1、髓鞘相关蛋白（MAG, PLP）及线粒体自噬相关蛋白（LC3β, PINK1, Parkin）的表达时序变化；采用全细胞膜片钳技术记录皮层锥体神经元的电生理活动以评估神经元兴奋性；通过卢克索固蓝（LFB）染色和透射电子显微镜（TEM）观察髓鞘完整性和线粒体超微结构；并利用Morris水迷宫实验评估大鼠长期空间学习和记忆能力。

研究结果首先通过HE染色证实了HI损伤导致的严重神经组织病理改变，包括组织疏松、空泡化及核固缩，而褪黑素治疗显著改善了这些病理变化。电生理学研究揭示，HI损伤后神经元表现出超兴奋性，其动作电位发放频率增加，阈值电位和静息膜电位去极化。褪黑素处理有效逆转了这种超兴奋性，降低了动作电位频率，并使阈值电位和静息膜电位恢复正常化。重要的是，当使用特异性NCX抑制剂SN6后，褪黑素的这种保护效应被完全抵消，神经元超兴奋性重现，这直接证明了褪黑素是通过调节NCX1活性来稳定神经元电活动的。

在髓鞘发育方面，LFB染色和髓鞘蛋白（MAG和PLP）表达分析均表明，HI损伤严重破坏了髓鞘的完整性，导致髓鞘染色变浅、结构紊乱及相关蛋白表达下调。褪黑素治疗显著促进了髓鞘的修复，增加了髓鞘密度和髓鞘蛋白的表达。透射电镜超微结构观察进一步提供了直观证据：HI组可见髓板层扭曲、空泡形成，而褪黑素组髓板层排列紧密、结构完整。同样，SN6的干预也逆转了褪黑素对髓鞘的保护作用。

分子机制层面，研究人员发现NCX1的表达在HI损伤后呈现双相性动态变化：在损伤早期（P7）代偿性上调，而在后期（P14, P21）则显著下调。褪黑素治疗有效调控了这种异常表达，早期抑制其过度上调，后期阻止其下降。与此同时，线粒体自噬标志蛋白LC3β、PINK1和Parkin在HI组表达显著升高，透射电镜下可见大量自噬溶酶体形成，表明PINK1-Parkin通路介导的线粒体自噬被过度激活。褪黑素处理显著抑制了这些蛋白的表达，减少了自噬活动，改善了线粒体结构（如线粒体嵴清晰）。而SN6的加入则重新激活了自噬通路，导致线粒体结构损伤和自噬标志蛋白表达上调，再次证实了NCX1在褪黑素抑制线粒体自噬中的核心作用。

行为学实验表明，HI损伤导致大鼠在Morris水迷宫中表现出血空间学习和记忆缺陷，表现为逃避潜伏期延长、目标象限停留时间缩短。褪黑素治疗显著改善了大鼠的认知功能，缩短了逃避潜伏期，增加了对原平台位置的记忆。而SN6处理则部分阻断了褪黑素的认知保护效应。

本研究通过综合性的实验方法，揭示了褪黑素在新生儿HI-induced WMD中发挥神经保护作用的一条新机制：即通过双向调控NCX1的表达，抑制PINK1-Parkin通路介导的过度线粒体自噬，从而减轻细胞内钙超载和氧化应激，改善神经元电生理稳定性，促进髓鞘修复，并最终改善长期认知功能。这一发现不仅深化了我们对HI脑损伤机制的理解，也为褪黑素作为神经保护剂的临床应用提供了坚实的理论基础和实验依据。鉴于褪黑素的安全性较高且易于通过生理屏障，它有望成为一种极具潜力的治疗策略，用于改善遭受HI损伤的新生儿，特别是早产儿的神经系统预后。本研究发表于《Journal of Molecular Histology》，为未来开发靶向NCX1和线粒体自噬的神经保护方案指明了方向。