疏水蛋白-蛋白A融合蛋白修饰的金纳米颗粒：构建多功能免疫传感新平台

本综述创新性地开发了一种基于Vmh2/SpA融合蛋白的金纳米颗粒（AuNPs）功能化策略，该平台通过生物工程手段将疏水蛋白（Vmh2）的自组装特性与蛋白A（SpA）的Fc结合功能相结合，实现了抗体的高密度、定向固定，显著提升了免疫传感性能（包括灵敏度与稳定性）。研究成功验证了其对真菌漆酶、肿瘤标志物间皮素及SARS-CoV-2刺突蛋白的检测能力，为医疗诊断、环境分析和生物技术创新提供了可持续、低成本且高效的解决方案。

　　

引言

免疫传感技术的发展高度依赖于新一代表面功能化策略的进步，因为抗体在传感器界面上的精确定锚对于实现高灵敏度和高选择性至关重要。在众多研究方法中，生物工程材料在改善抗体取向、稳定性和功能性能方面展现出显著潜力。本研究通过将来自平菇（Pleurotus ostreatus）的I类疏水蛋白Vmh2与来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的蛋白A（SpA）的Fc结合区域融合，构建了一种嵌合蛋白。该融合蛋白无需化学修饰即可自发吸附于金纳米颗粒（AuNPs）表面，形成坚固的生物交互层用于抗体附着。

材料与方法

载体构建

研究人员设计并合成了编码Vmh2蛋白、（Gly₄Ser）₃ linker、SpA（序列27-325，突变四个潜在N-糖基化位点为Q）及His标签的融合基因，该基因经密码子优化后插入pJGG_αkR载体，形成重组质粒pJGG_Vmh2/SpA。该质粒线性化后转化至毕赤酵母（Pichia pastoris）BG-23（蛋白酶缺陷型）和BG10（蛋白酶产生型）菌株。

蛋白表达与纯化

转化后的酵母菌落在BMMY培养基中培养，每日取样测定细胞密度并进行Western blot分析。为减少蛋白降解，在培养基中添加丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF（2 mM）并将培养温度降至20°C。最佳表达条件为28°C并添加PMSF，培养1天后收获上清液，经超滤浓缩和透析后用于后续实验。

金纳米颗粒功能化

采用已报道方法合成AuNPs（平均核心直径约20 nm），通过逐滴添加Vmh2/SpA蛋白溶液（50 μg/mL）进行功能化，获得Vmh2/SpA-AuNPs。以商业SpA蛋白为对照，制备SpA-AuNPs。通过UV-Vis光谱、动态光散射（DLS）和ζ电位测定表征功能化效果。

抗体固定与检测

将不同抗体（抗漆酶、抗间皮素、抗刺突蛋白）逐步添加到Vmh2/SpA-AuNPs中，孵育后离心重悬。采用两步法：先使抗体-抗原结合，再加入HCl（20 mM）诱导未结合分析物的AuNPs聚集，通过UV-Vis光谱记录400-750 nm吸收变化。

结果与讨论

Vmh2/SpA蛋白生产

在蛋白酶缺陷型菌株中，于28°C添加PMSF条件下，培养1天即可获得最高产量的融合蛋白（44 kDa）。Western blot显示单一条带，表明蛋白完整性良好。

AuNPs功能化

UV-Vis光谱显示功能化后LSPR峰红移，DLS显示流体动力学直径增加，ζ电位表明表面负电荷被屏蔽，证实Vmh2/SpA和SpA均成功修饰AuNPs。与SpA-AuNPs相比，Vmh2/SpA-AuNPs在固定抗漆酶抗体后检测漆酶活性高出65%，且稳定性更佳（4°C可保存4个月）。

系统性能评估

ζ电位测定表明，抗体浓度在15-30 μg/mL时可饱和Vmh2/SpA-AuNPs表面。通过两步法，发现抗体浓度≤7 μg/mL时，系统对抗原响应最敏感。校准曲线基于LSPR峰位波长变化构建，确定最佳抗体浓度为3.5 μg/mL。检测限（LoD）分别为漆酶0.38 nM、间皮素0.23 nM、刺突蛋白550 nM。间皮素的检测灵敏度达到临床相关范围，且在十倍稀释血清中仍有效。

结论

本研究开发的Vmh2/SpA-AuNPs平台融合了Vmh2的自组装特性和SpA的抗体结合能力，实现了抗体的高效、定向固定，显著提升了免疫传感性能。系统在多种抗体-抗原对中均表现出高灵敏度和稳定性，为医疗诊断、环境监测和生物技术创新提供了可持续、低成本的解决方案。未来可进一步集成于多通路或床旁检测设备，拓展其应用范围。