基于氢氧化钠（NaOH）脱细胞技术的人源神经移植物：推动外周神经再生的安全有效策略

本研究创新性地开发了一种基于氢氧化钠（NaOH）的人神经组织脱细胞技术，有效清除细胞成分和脂质，同时保留细胞外基质（ECM）结构与关键成分（如胶原和sGAG）。该技术显著降低残留洗涤剂毒性，在体外验证良好生物相容性，并在兔坐骨神经缺损模型中展现出与自体移植相当的功能与结构再生能力，为外周神经损伤修复提供新型安全可靠的移植物选择。

　　

引言：外周神经再生与脱细胞移植物的挑战

外周神经因其分布广泛而易受创伤、压迫及医源性损伤，再生过程复杂。当前，自体神经移植仍是修复的“金标准”，但其来源有限且伴随供区并发症。异体神经移植物虽具潜力，却面临免疫排斥风险。传统洗涤剂脱细胞法（如Sondell法和Hudson法）虽可降低免疫原性，但残留毒性及对细胞外基质（ECM）结构的破坏问题突出。针对这些局限性，本研究提出一种基于氢氧化钠（NaOH）的协同脱细胞策略，旨在通过优化试剂浓度与处理时间，实现高效脱细胞并最大限度保留ECM结构与生物活性。

材料与方法：脱细胞流程优化与多维度验证

人源神经组织取自手术剩余样本，经伦理审查批准。脱细胞流程包括异丙醇预处理、去离子水清洗、NaOH（0.25 N，16小时）与脱氧胆酸钠（SDC，4%，8小时）分步处理，最终通过伽马辐照灭菌。通过扫描电镜（SEM）、DAPI染色、组织化学染色（H&E、Masson Trichrome、Oil Red O）及生化检测（DNA、胶原、sGAG含量）系统评估脱细胞效果与ECM完整性。残留洗涤剂采用高效液相色谱（HPLC）量化。体外实验通过ISO 10993-5标准检测细胞毒性（L929成纤维细胞），并评估人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）在ECM涂层上的存活与增殖能力。

动物模型与功能评估

建立兔坐骨神经1.5厘米缺损模型，随机分为四组：自体移植组（Autograft）、NaOH脱细胞神经移植组（N-DCN）、缺损未处理组（Defect）及正常对照组（Native）。术后24周内通过步态分析测量踝关节站立角（ASA）及运动功能恢复率，并结合肌肉体积、重量及肌纤维直径变化评估运动功能恢复。组织学分析包括髓鞘再生（甲苯胺蓝染色与透射电镜）以及免疫组化检测神经丝蛋白（NF200）和层粘连蛋白（laminin）表达。

结果：NaOH脱细胞技术高效且安全

优化实验表明，0.25 N NaOH处理16小时可有效清除细胞核成分（DAPI染色阴性），且SEM显示ECM微观结构保持完整。与Sondell法和Hudson法相比，N-DCN组DNA残留量显著降低（134.44 ± 13.93 ng/mg），胶原含量相对升高（18.20% ± 1.29%），sGAG水平与正常组织相当，脂质残留显著减少（Oil Red O染色面积仅1%）。HPLC检测显示N-DCN无残留SDC，而Sondell组仍可检出。

体外实验验证生物相容性与促再生潜力

L929细胞与N-DCN提取物共培养后形态正常，细胞存活率达91%（ISO 10993-5分级为1级）。SH-SY5Y细胞在N-DCN来源的ECM上展现出高存活率与持续增殖趋势，CCK-8检测显示其增殖能力与正常组无显著差异。

动物实验证实功能与结构再生

步态分析显示，N-DCN组踝关节活动角度（61.5° ± 5°）与自体移植组（60° ± 12.2°）相当，且显著优于缺损组（26° ± 8.9°）。术后18周起，N-DCN组多数动物实现完全或部分运动功能恢复。肌肉形态学与组织学分析表明，N-DCN组肌肉萎缩程度（重量损失30% ± 0.06%，体积损失25% ± 0.01%）与自体移植组接近，远优于缺损组（重量损失56% ± 0.12%，体积损失49% ± 0.08%）。H&E染色显示N-DCN组肌纤维直径与密度接近正常水平。

髓鞘再生与分子水平验证

甲苯胺蓝染色与透射电镜（TEM）显示N-DCN组再生轴突髓鞘厚度、直径及数量与自体移植组无显著差异，而缺损组未见明显髓鞘结构。免疫组化结果显示，N-DCN组NF200（17.44 ± 0.59）与层粘连蛋白（27.89 ± 2.71）表达面积与自体移植组相当，显著高于缺损组，表明神经结构再生良好。

讨论：NaOH脱细胞技术的优势与转化前景

本研究证实NaOH辅助脱细胞技术可显著降低传统方法中洗涤剂使用量与残留风险，同时保留ECM中胶原等促再生成分。sGAG含量的控制可能减少抑制轴突再生的硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPG）负面影响。体外与体内实验一致表明该技术具有良好的生物安全性与促神经再生能力，功能恢复效果与自体移植相当。尽管兔模型已验证其在中度缺损修复中的有效性，未来需进一步探索大段缺损修复及临床转化潜力，并结合电生理学与细胞互作研究深化机制理解。

结论

NaOH基脱细胞人神经移植物在清除免疫原性成分、保留ECM结构、降低毒性残留及促进神经再生方面表现出显著优势，其功能恢复效果与自体移植相当，具备作为外周神经缺损修复理想替代材料的潜力。该技术为神经再生医学提供了更安全、有效且可规模化的移植策略。