XBP1s介导乳腺癌对CDK4/6抑制剂联合内分泌治疗的交叉耐药机制研究

本文揭示了XBP1s（X-box结合蛋白1剪接体）在HR+/HER2?乳腺癌中对CDK4/6抑制剂（如帕博西尼）和内分泌治疗（如氟维司群）联合疗法产生交叉耐药的关键作用。研究发现XBP1s通过转录激活SND1（葡萄球菌核酸酶结构域包含蛋白1），进而促进E2F1通路及其下游靶基因表达，绕过CDK4/6-cyclin D-Rb通路调控的G1/S期检查点，导致细胞周期异常进展和耐药性。通过表观遗传学干预（shRNA敲低）或药理抑制（IRE1α RNase抑制剂4μ8C）靶向XBP1s可显著恢复治疗敏感性。该研究为HR+/HER2?乳腺癌患者提供了新型生物标志物（XBP1s）和潜在治疗策略（靶向XBP1s-SND1-E2F1轴）。

　　

引言

激素受体阳性（HR+）/人表皮生长因子受体2阴性（HER2?）乳腺癌是最常见的乳腺癌亚型，占所有转移性乳腺癌（MBC）的60%。其发生发展主要受雌激素受体（ER）信号驱动，内分泌治疗（ET）是该亚型系统性治疗的基石。过去十年研究发现，ER信号与细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）4/6–cyclin D轴存在广泛交叉对话，且CDK4/6–cyclin D轴在细胞增殖和内分泌耐药中起核心作用。CDK4/6抑制剂通过阻断Rb蛋白磷酸化，抑制E2F转录因子释放及其驱动的S期进入相关基因转录，从而阻滞G1/S期转换并抑制肿瘤细胞增殖。临床研究证实，CDK4/6抑制剂联合内分泌治疗可显著改善晚期HR+/HER2?乳腺癌患者的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS），现已成为标准疗法。然而，耐药性问题日益突出，约10%–30%患者出现原发性耐药，近半数患者在治疗12个月内出现疾病进展，亟需探索耐药机制并寻找预测性生物标志物。

未折叠蛋白反应（UPR）是肿瘤细胞在快速增殖所致营养缺乏、缺氧及酸碱失衡等高压微环境下的关键生存机制。肌醇需求酶1α（IRE1α）–XBP1通路是最保守的UPR信号。UPR诱导后，IRE1α磷酸化并激活其RNase结构域，剪切XBP1 mRNA的26核苷酸内含子，生成剪接型XBP1（XBP1s）。XBP1s作为具有转录活性的异构体，可调控乳腺癌干性、迁移、血管生成及治疗耐药。例如，XBP1s在三阴性乳腺癌中调控缺氧应答基因并促进肿瘤进展；通过调节核因子κB（NF-κB）通路发挥促生存作用；且与ER信号存在正反馈循环。这些特性使XBP1s成为乳腺癌潜在治疗靶点。

本研究通过多组学分析及功能实验，首次证实XBP1s在HR+/HER2?乳腺癌中特异性高表达，且与CDK4/6抑制剂联合内分泌治疗的耐药性及不良PFS显著相关。机制上，XBP1s通过转录激活SND1，促进E2F1通路活性，从而抵消CDK4/6抑制剂的细胞周期阻滞作用。利用患者来源类器官（PDO）模型，进一步验证IRE1α RNase抑制剂4μ8C可阻断XBP1剪切，恢复治疗敏感性。该研究为克服联合治疗耐药提供了新靶点和策略。

XBP1s与转移性HR+/HER2?乳腺癌联合治疗耐药的相关性

为筛选HR+/HER2?乳腺癌特异性耐药驱动基因，研究团队采用交叉策略：首先对6例接受联合治疗的HR+/HER2? MBC患者转移灶活检样本进行RNA测序（RNA-seq），根据PFS是否≤6个月分为治疗敏感组和耐药组。基因集富集分析（GSEA）显示，耐药肿瘤中E2F靶标、IL6-JAK-STAT信号、KRAS信号、MYC靶标及PI3K-AKT-mTOR信号显著富集。通过整合TCGA和METABRIC数据库，发现XBP1和跨膜蛋白26（TMEM26）在HR+/HER2?肿瘤中表达显著高于其他亚型，且在耐药组中上调。在30例HR+/HER2? MBC患者的验证队列中，qRT-PCR证实XBP1高表达与较差PFS相关，而TMEM26无此关联。TCGA数据分析显示XBP1在乳腺癌组织中特异性高表达，且与内分泌耐药或CDK4/6抑制剂耐药队列（GSE224435、GSE229146、GSE229235）数据一致。

XBP1s作为XBP1的转录活性形式，在HR+/HER2?乳腺癌组织中表达显著升高。虽然XBP1表达与总生存（OS）无显著相关性，但XBP1s高表达与早期HR+/HER2?乳腺癌较差OS及MBC较差PFS显著相关。免疫组化（IHC）检测验证队列肿瘤样本显示，耐药组XBP1s评分显著高于敏感组，XBP1评分虽呈升高趋势但未达统计学意义。

为验证XBP1s在体内的耐药作用，研究构建了过表达XBP1s的MCF7细胞衍生异种移植（CDX）模型。结果显示，XBP1s过表达肿瘤对帕博西尼、氟维司群及其联合治疗均无明显消退，而对照组肿瘤则表现出显著治疗反应。IHC证实XBP1s过表达肿瘤中XBP1s阳性细胞比例升高，且药物治疗后该比例进一步增加，表明XBP1s阳性细胞具有耐药性。

XBP1s降低HR+/HER2?乳腺癌对帕博西尼、氟维司群及其联合治疗的敏感性

通过体外实验，研究发现XBP1s过表达显著降低MCF7和T-47D细胞对帕博西尼和氟维司群的敏感性，IC₅₀值升高且克隆形成能力增强。Western blot显示，XBP1s过表达细胞中E2F1蛋白水平持续上调，且帕博西尼处理后磷酸化Rb（p-Rb）降低程度与对照组相当，表明XBP1s可能通过上调E2F1促进G1/S期转换，逃避CDK4/6抑制剂的作用。细胞周期分析证实XBP1s过表达促进G1期退出并消除帕博西尼介导的G1/S期阻滞。

利用12例HR+/HER2?乳腺癌患者来源类器官（PDO）模型，研究发现XBP1s^high PDO对帕博西尼和氟维司群的敏感性低于XBP1s^low PDO。在PDO中过表达XBP1s可模拟耐药表型，表现为药物处理后类器官尺寸变化减小和剂量-反应曲线右移。

XBP1s抑制可增强HR+/HER2?乳腺癌细胞对帕博西尼和氟维司群的敏感性

通过shRNA敲低XBP1，MCF7和T-47D细胞对帕博西尼和氟维司群的敏感性显著恢复。使用IRE1α RNase抑制剂4μ8C和MKC8866处理，可剂量依赖性降低XBP1s mRNA及其下游靶基因表达，并抑制细胞增殖、诱导G1期阻滞。联合用药实验显示，4μ8C与帕博西尼或氟维司群具有协同抗增殖效应（CI<1）。

XBP1s过表达促进HR+/HER2?乳腺癌细胞增殖和G1/S期转换

RNA-seq和GSE分析显示，XBP1s过表达细胞中MYC靶标、雌激素早期反应及E2F靶标显著富集。EdU和细胞活力实验证实XBP1s促进细胞增殖。体内实验显示XBP1s过表达加速肿瘤生长。细胞周期同步化实验发现XBP1s过表达缩短G1期持续时间，加速S期进入。Western blot检测到XBP1s过表达细胞中E2F1、cyclin A2、cyclin E1和CDK2蛋白水平升高，表明XBP1s通过调控G1/S期关键调节蛋白促进细胞周期进展。

XBP1s转录激活HR+/HER2?乳腺癌中的SND1

通过整合ChIP-seq和RNA-seq数据，发现XBP1s结合于SND1启动子区域。临床样本中XBP1s与SND1表达呈正相关。XBP1s过表达细胞中SND1 mRNA和蛋白水平显著升高。JASPAR数据库预测XBP1s结合位点（相对评分0.98），ChIP-qPCR证实XBP1s与该位点结合。双荧光素酶报告实验显示XBP1s剂量依赖性激活野生型SND1启动子活性，而对突变型无影响。4μ8C处理可降低SND1蛋白水平。这些结果证实SND1是XBP1s的直接转录靶标。

SND1驱动E2F1靶基因激活介导XBP1s诱导的增殖和耐药

SND1过表达促进MCF7和T-47D细胞增殖、克隆形成及G1/S期转换，并上调E2F1、cyclin A2、cyclin E1和CDK2蛋白水平。相反，SND1敲低则抑制这些表型。挽救实验表明，SND1敲低可部分逆转XBP1s介导的增殖促进、G1/S期加速及耐药性。

Co-IP和免疫荧光证实SND1与E2F1相互作用并共定位于细胞核。SND1过表达上调E2F1靶基因转录。临床样本中XBP1s与E2F1及其靶基因（CCNE1、CCNA2、RRM2）表达正相关。帕博西尼处理降低E2F1蛋白水平和SND1-E2F1相互作用，但XBP1s过表达可恢复帕博西尼抑制的E2F1靶基因表达。

体内实验显示，XBP1s过表达肿瘤中SND1、E2F1和Ki67水平升高，且帕博西尼或氟维司群单独处理未能有效抑制其表达，联合治疗仅引起轻微下降。XBP1s过表达肿瘤中E2F1靶基因表达始终高于对照组。

4μ8C增敏HR+/HER2?乳腺癌对帕博西尼联合氟维司群的治疗

在PDO模型中，4μ8C处理降低XBP1s mRNA水平及其下游靶基因表达。联合指数（CI）模型证实4μ8C与帕博西尼或氟维司群具有协同作用。活/死染色显示三联治疗（帕博西尼+氟维司群+4μ8C）诱导更多细胞死亡。XBP1s过表达PDO对联合治疗耐药，而4μ8C可恢复其敏感性。

在MCF7 CDX模型中，三联治疗显著抑制肿瘤生长，降低XBP1s、SND1和E2F1蛋白水平，且耐受性良好。

讨论

本研究系统阐述了XBP1s作为HR+/HER2?乳腺癌联合治疗耐药的关键驱动因子。其通过转录激活SND1，增强E2F1通路活性，从而绕过CDK4/6-cyclin D-Rb通路介导的细胞周期阻滞。XBP1s高表达患者可能无法从联合治疗中获益，而靶向XBP1s（如使用IRE1α RNase抑制剂）可恢复治疗敏感性。尽管IRE1α RNase抑制剂同时抑制XBP1s产生和调节性IRE1α依赖性衰减（RIDD），可能带来脱靶效应，但本研究为开发特异性XBP1s抑制剂（如PROTACs）提供了理论依据。

结论

XBP1s通过调控SND1/E2F1轴促进HR+/HER2?乳腺癌细胞增殖、G1/S期转换及对帕博西尼和氟维司群的交叉耐药。XBP1s高表达患者可能不适合联合治疗，而靶向XBP1s可成为潜在策略。未来需进一步探索特异性靶向XBP1s的治疗方法。

实验方法

研究使用临床样本、细胞系、PDO模型及CDX模型进行多维度验证。技术手段包括RNA-seq、ChIP-seq、Western blot、qRT-PCR、流式细胞术、免疫组化、免疫荧光、Co-IP、双荧光素酶报告实验等。统计分析采用Student's t检验、ANOVA、Log-rank检验等，p<0.05为显著差异阈值。