M2巨噬细胞介导子宫内膜异位症遗传风险并揭示与共病性状的基因多效性

本综述通过整合超过45万人的遗传风险数据与21名患者的约35万个单细胞转录组，首次揭示M2巨噬细胞是子宫内膜异位症（Endometriosis）遗传易感性的关键驱动因素，并确定IL1信号通路（IL1 signaling）为受胚系遗传变异影响的核心枢纽。研究通过功能实验验证IL1A/IL1B在疾病发生中的作用，并证明IL1受体拮抗剂安纳金钠（anakinra）在小鼠模型中显著减轻疼痛和病灶血管生成信号。该发现为开发非激素靶向疗法提供了重要依据。

　　

引言

子宫内膜异位症是一种常见但机制不明的妇科疾病，影响约10%的育龄女性及跨性别男性。其特征是子宫内膜样腺体和间质出现在子宫腔外，常累及卵巢和腹膜腔，导致慢性疼痛、痛经和不孕，并增加特定卵巢癌风险。除诊断性上皮和间质细胞外，微环境中的免疫细胞（如纤维化和先天/适应性免疫反应异常）在疾病发病中起关键作用。全基因组关联研究（GWAS）已发现数千种与复杂性状相关的常见遗传多态性，包括子宫内膜异位症。以往研究多关注子宫内膜上皮细胞与风险的关联，但微环境细胞的作用尚未充分探索。

单细胞疾病风险评分关联M2巨噬细胞与子宫内膜异位症风险

通过重新分析21名患者的腹膜子宫内膜异位症（n=32）、子宫内膜异位囊肿（n=8）、无病变卵巢（n=4）和在位子宫内膜（n=10）的单细胞图谱，研究团队注释了118103个CD45阳性（PTPRC表达）免疫细胞，将其分为15个功能不同的群体。T细胞亚群包括5个CD8 T细胞簇（63906个细胞）、γδ T细胞（16284个细胞）、Th2 CD4 T细胞（6843个细胞）和Th17 CD4 T细胞（920个细胞）。髓系亚群包括8790个树突状细胞、1139个M1巨噬细胞和5554个M2巨噬细胞。其余免疫群体包括B细胞（5274个细胞）、浆母细胞/浆细胞（1771个细胞）、自然杀伤（NK）细胞（5977个细胞）和肥大细胞（1645个细胞）。数据集中的其他细胞类型包括子宫内膜样上皮（8160个细胞）和子宫内膜样间质（66721个细胞），以及间充质细胞（125311个细胞）、间皮细胞（2865个细胞）和内皮细胞（23226个细胞）。

使用单细胞疾病相关性评分（scDRS）软件整合单细胞转录组谱与基于450668例对照和23492例子宫内膜异位症病例的GWAS荟萃分析数据，以识别与疾病风险相关的细胞类型/亚型。在免疫细胞中，髓系簇的评分最高，T细胞倾向于负值，NK细胞略有增加。平均评分前五的细胞类型为M2巨噬细胞（1.38）、B细胞（0.68）、树突状细胞（0.60）、内皮细胞（0.49）和平滑肌细胞（0.27）。M2巨噬细胞（p=0.01）、树突状细胞（p=0.05）和内皮细胞（p=0.04）与子宫内膜异位症遗传风险显著相关，B细胞未达到统计学显著性（蒙特卡罗检验p=0.051）。在细胞类型内部，M2巨噬细胞（p=0.03）、树突状细胞（p=0.03）和浆细胞/浆母细胞（p=0.05）检测到异质性，表明这些细胞的亚群驱动与疾病的关联。尽管晚期子宫内膜异位症具有更高的遗传度，但按阶段分层时，从I/II期与III/IV期患者分离的细胞在scDRS评分上未见差异。细胞类型解释的评分方差是阶段的14.65倍。

巨噬细胞来源的IL1A/IL1B作为2q41.1位点遗传变异介导风险的可能介质

为理解与M2巨噬细胞、树突状细胞和内皮细胞的关联，研究识别了与风险评分表达相关的基因及其影响的通路。在数据集的30354个特征中，相关性值围绕0分布，但M2巨噬细胞、树突状细胞和内皮细胞中分别有1642、3365和4157个基因与scDRS评分显著相关（调整后p<0.05）。IL1A和IL1B是在两个髓系亚群中正相关性最高的顶级基因（IL1A在M2巨噬细胞中的斯皮尔曼相关性为0.59，树突状细胞中为0.36；IL1B在M2巨噬细胞中的相关性为0.51，树突状细胞中为0.46，每次检验调整后p<2.61×10^?222）。内皮细胞的顶级基因不同，但包括已知与子宫内膜异位症相关的基因。KDR（编码VEGFR2）上游的变异与疾病严重程度相关；CALCRL作为CGRP的共受体影响病灶大小和疼痛；LIF受体有助于病灶免疫调节。

在通路水平上，不同白细胞介素的信号传导在髓系细胞的正相关基因中高度富集（调整后p<1.97×10^?08）。此外，翻译相关通路高度代表，尤其是内皮细胞的负相关基因。在三种与子宫内膜异位症相关的细胞类型中，两个髓系群体显示出显著的细胞类型内疾病关联异质性。为检查这种异质性是否与细胞功能相关，使用PROGENy评分估计通路活性。比较分箱的通路评分与平均scDRS，风险与通路活性之间存在正相关，尤其是NF-κB（斯皮尔曼相关性=0.92，p值2.01×10^?7）和TNF-α（斯皮尔曼相关性=0.80，p值1.2×10^?6），M2巨噬细胞达到比树突状细胞、浆细胞或内皮细胞更高的活性水平。未检测到scDRS分箱与通路活性之间的其他显著相关性，包括PI3K通路（在子宫内膜异位症中体细胞改变）。

IL1A和IL1B在NFκB信号反馈环中功能，并被提出为染色体2q14.1位点的可能因果风险基因，该位点在多个人群中与子宫内膜异位症相关。子宫内膜异位症风险变异位于白细胞介素1A启动子着丝粒约2 kb处。尽管该位点包含十几个蛋白质编码基因，但大多数候选风险基因在单细胞子宫内膜异位症图谱的任何细胞类型中均不表达。IL1A和IL1B在M2巨噬细胞中高表达。子宫内膜异位症相关的M2巨噬细胞也表达IL1A/B拮抗剂IL1RN，这可能也有助于微调IL1信号传导和该位点变异带来的风险。这些数据表明M2巨噬细胞来源的IL1A/B可能参与子宫内膜异位症风险。

表达数量性状位点（eQTL）分析将子宫内膜异位症风险SNP与候选基因包括IL1A和IL1B的表达联系起来

将染色体2q14.1位点的子宫内膜异位症风险变异映射到eQTL，以识别证据表明IL1A和/或IL1B的遗传调控表达差异由与子宫内膜异位症风险相关的相同变异赋予。使用Fuma软件和One1K单细胞eQTL数据，查询了代表37种不同组织类型的139个eQTL数据集。IL1A表达降低与10种不同组织类型的风险增加相关（p<10^?5）。子宫内膜异位症风险升高与两种髓系细胞类型（单核细胞、树突状细胞）中IL1B表达降低相关，并在三个数据集中与表达升高相关。IL1A检测到的关联数量最多（10个eQTL）。IL1B和PSD4检测到5个eQTL关联。IL1A关联的数量和强度，以及IL1B的髓系特异性关联是将这些基因与子宫内膜异位症风险联系起来的进一步证据。为检验相同变异是否与风险和IL1A和/或IL1B表达相关，对选定组织类型进行了共定位分析。这揭示了子宫内膜异位症风险变异与IL1A eQTL共享因果变异的证据。IL1B eQTL的信号似乎独立于子宫内膜异位症风险关联，可能是连锁不平衡的结果。

M2巨噬细胞在子宫内膜异位症旁分泌信号传导中的核心作用

使用CellChat预测子宫内膜异位症中细胞类型之间的信号传导。总共识别了192个配体-受体对和4056个预测的细胞类型间连接（p<0.05）。非免疫细胞预测形成更多传出而非传入连接，而免疫细胞则相反。例如，子宫内膜样间质细胞展示439个传出和99个传入连接；相比之下，早期耗竭T细胞参与124个传出和385个传入信号。非免疫细胞往往比免疫细胞更连接，平均分别为465和362个交互。在免疫细胞中，M2巨噬细胞和早期耗竭T细胞特别连接，分别有549和528个连接。与其他免疫细胞相比，M2巨噬细胞与非免疫细胞异常连接，形成229个交互，而早期耗竭T细胞作为第二连接亚群有157个连接。

非免疫细胞与M2巨噬细胞之间的交互主要是传入性的，并集中在胶原通路上。有些通路受到相同小套配体-受体对的影响，这些对在各种细胞类型中 indiscriminately 表达，如传入CD99和传出半乳糖凝集素；而其他通路与 distinct 配体-受体对相关，影响一小套细胞类型，如传入胶原、传入MHC-I以及传入和传出MHC-II。非免疫细胞在M2巨噬细胞传出交互的接收者中 underrepresented，髓系细胞、耗竭CD8 T细胞和NK细胞是主要目标。所有这些表明M2巨噬细胞在用于诊断的非免疫簇与免疫群体之间的交叉对话中起核心作用。总体而言，M2巨噬细胞代表了几种通路的通信瓶颈，包括传出TNF和传入内脂素信号传导。在其他实例中，如CXCL通路，髓系细胞（包括M2巨噬细胞）参与与多种细胞类型的传入和传出信号传导，特异性由表达的受体和配体分子决定。

IL1信号传导未在CellChat分析中识别，可能由于共受体IL1RAP的低表达。因此，对非免疫细胞类型进行了靶向调查，寻找M2巨噬细胞产生的IL1A/B的可能效应细胞。除MUC5+子宫内膜样上皮细胞外，所有子宫内膜样上皮（EnEpi）和间质（EnS）亚型的IL1转录特征平均表达超过非免疫细胞类型，表明它们可能是IL1信号传导的接收者。子宫内膜样间质细胞和IHH+SPDEF+子宫内膜样上皮细胞亚型在非免疫细胞类型中展示最高的IL1特征平均表达。为评估病例和对照在位子宫内膜细胞中IL1信号传导基因的表达，对新鲜分离的原代EnEpi和EnS进行了批量RNA测序。批量RNA测序提供更深度的覆盖，可以识别比单细胞测序更多低表达基因。分析涉及IL1信号传导的13个基因揭示上皮和间质细胞中相似的表达模式，EnEpi内患者间变异更大。IL1R2（p<0.01）和信号中介IRAK1（调整后p=0.02）和IRAK4（调整后p=0.01）显示EnEpi和EnS之间最显著的差异。IL1R1在两种细胞类型中高表达，但相关蛋白IL1RAP相对较低，与单细胞数据一致。IL1A和IL1B相对于受体IL1R1和效应器IRAK1和NFKB2低表达，符合上皮和间质作为IL1信号传导接收者而非这些白细胞介素主要来源的情况。在位子宫内膜来自子宫内膜异位症病例的样本也倾向于表达更高IL1R1和更低IL1A和IL1B。

IL1B处理子宫内膜类器官共培养体外破坏上皮分化

当在Matrigel中与 defined 生长因子维持时，EnEpi细胞与EnS或子宫内膜间充质干细胞共培养自发创建复杂的类器官结构，密切模仿体内人类子宫内膜的组织学和功能分化。从六名疑似子宫内膜异位症患者的月经液分离上皮细胞，其中五名通过腹腔镜手术确认子宫内膜异位症，第六名未接受手术，子宫内膜异位症状态未确认。从八名不同患者（4名有子宫内膜异位症，4名无）的子宫内膜活检中分离间质细胞，将两种细胞类型共培养建立类器官-间质共培养。对类器官进行单细胞RNA测序后，从子宫内膜异位症细胞图谱转移细胞身份，将上皮细胞分为纤毛和非纤毛亚群。IL1信号传导在纤毛细胞中相对于非纤毛上皮升高，尽管IL1A和IL1B低表达。IL1信号传导仅在纤毛细胞中与雌激素信号传导正相关（p=0.017），符合雌激素对纤毛发生的已知作用以及雌激素和IL1转录靶点的 substantial 重叠（89.47%的IL1信号传导基因也受雌激素调控）。

为测试IL1B暴露在体外的影响，将子宫内膜上皮细胞和子宫内膜间充质干细胞的单细胞悬液接种到Matrigel中，并在有利于生成3D体外子宫内膜类器官的条件下培养。为模拟子宫内膜发育和月经周期变化，用雌二醇（E2）处理类器官-间质共培养，刺激细胞增殖， characteristic 增殖期（卵泡期）子宫内膜。E2与孕酮（P4）组合导致过渡到 elongated 蜕膜化间充质间质细胞结和上皮腺体结构扩张，模仿成熟分泌期子宫内膜的形态和结构。用IL1B处理成熟、蜕膜化的类器官-间质共培养导致细胞形态剧烈改变，上皮腺体结构广泛重组。 disrupted 腺体分化导致上皮 spread 和 infiltration 到周围蜕膜化间质中。

IL1R拮抗剂治疗在体内减轻疼痛敏感性

由于scDRS和体外结果支持IL1信号传导在子宫内膜异位症发病中的核心作用，评估了使用安纳金钠 disrupt 细胞间IL1信号传导在 validated 小鼠子宫内膜异位症相关疼痛模型中的效果。安纳金钠是白细胞介素-1受体拮抗剂的药理学优化重组版本，IL1RN基因的产物。通过注射来自雌激素预处理供体动物的 dissociated 子宫片段到同系受体腹腔中诱导子宫内膜异位症样病变。 blinded 研究者使用von Frey纤维在第0天和之后每周测量 evoked 疼痛。在第29天，将动物块随机分配到治疗组并治疗4周。实验结束时， blinded 研究者测量 evoked 疼痛、自发疼痛（腹部收缩和腹部扭曲）以及病变大小和数量。安纳金钠治疗导致自发疼痛和 evoked 疼痛显著、剂量依赖性减少。

然后对病变进行切片并使用Masson's trichrome染色，评估组织面积和胶原染色。发现安纳金钠治疗减少了组织负荷，尽管 gross 病变大小在各组之间没有差异。同样，观察到病变胶原染色减少。由于已知IL1信号传导显著影响血管生成，还评估了安纳金钠治疗对病变裂解液中血管生成调节环境的影响。通过斑点印迹测量，发现治疗降低了超过20种血管生成调节因子的浓度至少两倍。最 prominently，它降低了病变中VEGF的浓度超过10倍（ vehicle, 5.6 μg mL^?1 vs. anakinra, 0.5 μg mL^?1）。 together，这些数据表明IL1通过促进血管生成、增加组织负荷和纤维化 contribute 到病变进展。

M2巨噬细胞解释与免疫和疼痛状况的遗传相互作用

大量文献记录了子宫内膜异位症与炎症状况之间的流行病学和遗传联系。哮喘（ odds ratio [OR]=1.35, 95% confidence interval [CI]=0.97–1.88）、慢性疲劳综合征和/或纤维肌痛（OR=5.81, 95% CI=1.89–17.9）、单核细胞增多症（OR=1.75, 95% CI=1.14–2.68）、过敏（OR=1.76, 95% CI=1.32–2.36）和类风湿关节炎（ incidence rate ratio=1.31, 95% CI: 1.05–1.64）都与子宫内膜异位症相关。为检查子宫内膜异位症微环境的其他风险关联，使用来自16个性状GWAS的摘要统计数据计算scDRS。B细胞（但不是浆细胞）、树突状细胞、M1和M2巨噬细胞以及功能性T细胞亚群都与关节炎、哮喘和肠易激综合征相关。树突状细胞、M1和M2巨噬细胞以及子宫内膜样上皮都与腹部和盆腔疼痛相关，但与背痛无关。子宫内膜异位症与透明细胞和子宫内膜样卵巢癌风险相关，但与高级别浆液性亚型的联系较不一致。M2巨噬细胞和子宫内膜样间质与透明细胞卵巢癌相关。子宫内膜样上皮、间皮细胞和其他结构细胞与高级别浆液性卵巢癌和/或激素敏感性癌症（绝经后乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌和甲状腺癌）相关，可能反映这些癌症风险的共享细胞内在成分。有些出乎意料的是，与绝经年龄相关的细胞类型与关节炎、哮喘和肠易激综合征相似，表明免疫细胞在绝经年龄遗传成分中的作用比以前认为的更大。

讨论

子宫内膜异位症对女性健康有 myriad 长期负面影响。没有已知的高外显率胚系突变 contribute 到子宫内膜异位症风险；但子宫内膜异位症风险的 substantial 成分是遗传的，双胞胎研究估计遗传度为47%–51%。大多数子宫内膜异位症的遗传风险是由于常见 mild-risk 变异的组合效应。到目前为止，已识别出42个子宫内膜异位症风险位点。迄今为止的 post-GWAS 研究解释一直关注子宫内膜样上皮细胞的作用，然而，鉴于微环境在疾病发病中的核心作用，这可能 overlook 了风险的一个关键方面。这里，通过整合子宫内膜异位症的单细胞基因表达谱与子宫内膜异位症的GWAS数据，M2巨噬细胞、树突状细胞和内皮细胞与子宫内膜异位症风险相关，表明这些细胞在疾病易感性和发展中起作用。靠近白细胞介素1A基因位点的遗传变异证据是子宫内膜异位症最早识别的风险区域之一。在所有细胞因子家族中，IL1最与 damaging 炎症相关，并 predicted 调节子宫内膜异位症症状学。在这项研究中，IL1A/IL1B信号传导被识别为驱动M2巨噬细胞与子宫内膜异位症关联的主要效应器。有些出乎意料的是，在eQTL分析中， lower IL1A表达与风险增加相关，表明 muted 炎症反应可能对发生子宫内膜异位症有保护作用。然而，eQTL结果应谨慎解释，因为IL1A和IL1B已知具有高度 context-specific 效应，它们在子宫内膜异位症发展和症状学中的作用尚未完全定义。

细胞间通信的计算推断将M2巨噬细胞定义为免疫和非免疫细胞之间信号传导的主要枢纽，IL1特征在子宫内膜样间质和上皮亚群中激活，识别病变中这些诊断细胞作为子宫内膜异位症中IL1信号传导的效应器。IL1A和IL1B都通过白细胞介素受体（IL1R1）信号传导调节NF-κB、cJUN和p38 MAPK信号传导，诱导包括IL8在内的许多基因表达。IL8（由CXCL8基因编码）的表达也与子宫内膜异位症单细胞疾病风险评分相关，表明多种风险变异可能汇聚调节IL1通路的不同组件。风险评分与NF-κB和TNF-α信号传导正相关，与先前观察到的子宫内膜异位症巨噬细胞中 triggered 炎症反应一致。表达QTL分析识别了血液中与IL1A和IL1B的关联，表明一个模型，其中巨噬细胞从血液中循环的单核细胞分化， contribute 到多种炎症性状的风险，包括子宫内膜异位症。在这个多效性模型中，受体表达发生在疾病相关细胞类型中——这里，子宫内膜异位症中的上皮和间质细胞。由于IL1A以 constitutive 方式表达而IL1B需要 triggered，IL1A将首先释放， facilitating 播种。随后的IL1B表达将放大炎症信号并 favor 病变生长。病变建立的压力和 subsequent 炎症将 reinforce 维持 elevated IL1信号传导的正反馈环。如果与子宫内膜增生有任何相似之处，这种上皮-巨噬细胞交互将对病变增殖关键。

M2巨噬细胞和树突状细胞也与与子宫内膜异位症有遗传关联的免疫相关性状相关，表明多效性多细胞机制可能解释疼痛和炎症状况之间的遗传重叠。子宫内膜异位症患者中促炎巨噬细胞的增加让人想起自身免疫中发生的M1/M2巨噬细胞比率升高，与过敏性哮喘和肿瘤增殖和入侵相关的扩展M2群体相反。IL1信号传导可能 feasibly 参与观察到的多效性关联。IL-1β分泌增强是子宫内膜异位症和自身炎症性疾病的特征。此外IL1R1变异可能链接子宫内膜异位症和哮喘，因为子宫内膜异位症和肺肺泡上皮细胞都表达这个基因。

体内靶向IL1信号传导与安纳金钠减少了诱导子宫内膜异位症小鼠的疼痛症状。这与最近一项人类试点试验一致，该试验报告接受3个月治疗的患者与安慰剂相比，痛经（月经期盆腔疼痛）减少和生活质量改善。尽管疼痛缓解通常独立于病变缓解，但病变组织含量的减少强烈表明组织来源的有害 agent(s) 减少可能解释对疼痛的影响。IL1B蛋白表达与神经发生以及间质细胞迁移和入侵的联系表明IL1受体拮抗剂治疗可能对病变具有多效性效应，使这成为子宫内膜异位症特别有吸引力的治疗策略。安纳金钠对动物研究中疼痛的特定效应也 promising，施用10 mg/kg预防复杂区域疼痛综合征，30 mg/kg抑制骨肉瘤诱导的热痛觉过敏和100 mg/kg阻断骨肉瘤诱导的机械痛觉过敏但需要高达300 mg/kg预防炎症性热痛觉过敏。这里使用的中等剂量（30 mg kg^?1）表明 efficacy，增加安纳金钠用于子宫内膜异位症治疗的吸引力。另一方面，IL1A和IL1B与IL18、IL33、IL36A、IL36B、IL36G、IL37和IL38的相互作用表明通过 compensatory 上调相交通路的抵抗可能是一个挑战，因此可以考虑联合疗法。然后，尽管宫颈阴道液中IL-1α水平的评估具有患者分层的潜力，但鉴于子宫内膜异位症相关炎症的复杂性，可能还需要考虑其他炎症标志物。

这项研究的一个主要限制是对基因表达的依赖性。单细胞疾病评分评估GWAS推定基因的过量表达，但当我们关注与评分相关的顶级基因时，减少基因表达的风险变异被 overlook。基因表达数据集的样本量也可能 bias 观察。表观基因组和功能研究将需要因果链接子宫内膜异位症相关的非编码遗传变异与M2巨噬细胞功能和修改的IL1信号传导。虽然用重组IL1B处理上皮-间质共培养 minimizes 混淆因素，但我们最终 aim 将巨噬细胞整合到这些模型中；要么从具有相关基因型的个体分离巨噬细胞，要么使用CRISPR/Cas9基因组编辑工程化它们。这将需要广泛优化三重共培养系统，和大 replicate 数量以解释遗传背景变异性。

除了手术，激素 therapy 和疼痛管理是子宫内膜异位症最常见的治疗方法。激素 therapy 包括二线GnRH类似物，以及一线孕激素或联合激素避孕药；通过抑制子宫内膜异位症组织的 cyclic 增殖缓解疼痛。尽管反应率相当好，但由于需要长期治疗一种约50%患者症状复发的疾病， secondary 效应可能成为问题。Relugolix和elagolix是过去10年中FDA批准用于子宫内膜异位症治疗的仅有的新药物，两者都是GnRh拮抗剂，产生 transient 医学绝经并抑制排卵。它们以 around 73%和56%的比率减少痛经和非月经性盆腔疼痛，当联合 therapy 给药时骨密度损失最小。由于低雌激素状态的 side effects，这些药物只能使用6–24个月，限制其长期使用。在孕激素中，地诺孕素已被高度使用；据报道提供与GnRH等效的疼痛缓解和损伤减少， side effects 包括月经改变、骨量减少、头痛、体重增加和性欲减少。比较地诺孕素与联合避孕药的研究发现疼痛减少没有差异，但联合避孕药组有更多 adverse effects，包括异常子宫出血、情绪波动、头痛、恶心和乳房触痛。除了中度到更严重的 side effects，激素 therapy 不是计划怀孕患者的选择。

另一方面，安纳金钠自2001年以来被批准用于类风湿关节炎治疗，并正成功 off-label 用于多种炎症 based 疾病。注射部位反应是最常见的 adverse effect， reported 在71%的患者中。尽管IL1抑制剂与严重感染风险增加相关，但有剂量效应 specifically 警告 against 高剂量（?100 mg安纳金钠）。尽管在妊娠和哺乳期间未报告 adverse outcomes 增加，但需要更多数据。在安纳金钠用于子宫内膜异位症治疗的试点试验中，对月经周期没有影响，对于寻求生育的患者是一个 desirable 属性，并且患者的生活质量被安纳金钠显著改善。需要更大规模的试验与切除组织的详细分析来剖析安纳金钠对子宫内膜异位症有益效应的机制基础，但存在一个明确的机会窗口来控制这种疾病中 pervasive 病理炎症。证据汇聚 highlighting IL1A/B作为子宫内膜异位症中促炎信号传导的核心枢纽， together 与 promising 早期临床数据支持继续研究IL1R therapy 用于子宫内膜异位症，那里急需新的非激素治疗选择。