基于深度强化学习的抗菌肽智能设计模型AMPainter：实现抗菌活性精准“绘制”与功能进化

本刊推荐：本研究创新性地开发了基于深度强化学习（DRL）的抗菌肽（AMP）设计框架AMPainter，成功整合了序列优化（已知AMP活性提升）与从头生成（de novo设计）双重任务。该模型通过策略网络定位突变位点、经微调蛋白质语言模型（Ankh）解码残基类型，并依托超图神经网络活性预测器（HyperAMP）进行迭代优化，实现在已知AMP、信号肽（SP）及随机序列三类底物中高效进化出高活性AMP（实验验证成功率最高达80%）。多项进化肽表现出128倍抗菌活性提升（MIC降低），且体内外实验验证其膜靶向特异性与低耐药性诱导潜力，为耐药菌感染防治提供了人工智能驱动的创新方案。

　　

1 引言：抗菌肽设计的挑战与机遇

微生物耐药性问题日益严峻，每年导致超70万人死亡，预计2050年可能达千万。抗菌肽（AMP）因膜破坏机制和广谱抗菌特性，成为克服耐药性的理想候选药物。尽管现有数据库收录超过3万种AMP，但其在巨大序列空间中分布稀疏，需进一步探索。计算模型为AMP发现和优化提供了高效途径，现有方法可分为优化（提升已知AMP活性）和生成（从头设计）两类，但当前模型多针对特定场景开发，缺乏统一框架。定向进化案例启示我们：通过施加进化压力，可增强蛋白质原有功能或获得新能力。强化学习（RL）在蛋白质工程中展现出探索广阔序列空间（20^L）的潜力，但其在从头序列设计中的应用仍受限。

2 方法创新：AMPainter框架设计与核心模块

AMPainter模型包含三个核心模块：策略网络（Policy Network）选择突变位点、微调蛋白质语言模型（Ankh）解码残基类型、以及抗菌活性预测器HyperAMP评估突变序列。其中HyperAMP采用多级超图神经网络（HGNN），将肽序列划分为2/3/4-gram片段构建超图，利用残基级节点特征（Ankh嵌入）和片段TF-IDF权重进行消息传递，最终 concatenate 多级嵌入进行回归预测。该模型在测试集上Pearson相关系数达0.9220±0.0009，RMSE为0.1631±0.0001，显著优于传统Transformer、CNN-LSTM等基线模型。

训练过程中，AMPainter采用REINFORCE算法进行策略梯度更新，每条序列经历8次迭代突变（平衡活性与多样性）。模型在40个训练周期中，平均奖励分数从0.26提升至0.78，验证了框架的有效性。特别值得注意的是，通过微调语言模型桥接突变解码，显著提升了进化效率（对比未微调版本和随机突变基线）。

3 性能验证：全方位超越现有方法

在已知AMP优化任务中，AMPainter与10种主流方法（包括HydrAMP类比生成模式、EvoPlay、PEX、MCMC等）进行对比。使用200条未见AMP序列测试表明：

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  经MBC-Attention和AMP-READ模型评分，AMPainter进化序列抗菌活性分布显著优于对照组（p<0.001）

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  六种AMP分类器（AMPScannerV2、CAMPR4系列、MACREL、ampir）预测概率均值＞0.9

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  序列多样性分析（Levenshtein距离）显示，Top50/100序列多样性居首

  在Pg-AMP1片段优化实验中，AMPainter经5轮进化获得0.624的适应度分数，超越遗传算法（GA）和三种VAE模型，且进化序列呈现典型的两亲性螺旋结构（富含亮氨酸L和精氨酸R交替模式）。

4 多场景应用：三类底物的高效进化

模型在三种初始序列集上展现强大进化能力：

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  已知AMP优化：200条AMP经进化后，最佳序列评分显著提升（Δscore＞0），实验验证A05肽对枯草杆菌MIC从16μM降至0.25μM（活性提升64倍）

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  信号肽（SP）转化：708条细菌信号肽经进化后，80%（8/10）实验验证成功获得AMP功能，且所有HC₂₅值＞128μM，显示优异膜选择性

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  随机序列从头设计：200条随机序列进化后，60%（6/10）成为功能性AMP，其中R04肽对四种细菌平均MIC仅2.88μM（对金黄色葡萄球菌MIC低至0.5μM）

  进化序列氨基酸频率分析显示：阳性电荷残基（K/R）频率显著增加，阴性电荷残基（D/E）几乎完全被替换，疏水残基（L/I）占比提升，与天然AMP分布特征高度一致。

5 实验验证：活性与机制深度解析

30条合成肽的抗菌实验显示：

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  所有已知AMP进化肽均保持抗菌活性（MIC≤128μM）

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  SP进化肽成功率80%，随机序列进化肽成功率60%

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  R04肽展现卓越广谱活性（对革兰阳性菌效果更优）

  膜选择性机制通过分子动力学（MD）模拟验证：构建大肠杆菌内膜（含PE/PG脂质）和人血浆膜（POPC/POPE/SM/胆固醇）模型，6种高选择性指数（SI）肽均显示更高细菌膜相互作用比例（重原子接触距离＜3.5?）。静电作用为主要驱动力——细菌膜负电荷密度显著高于人源膜。

6 进化路径分析：从随机序列到高效AMP的蜕变

以从头设计AMP R04（26残基α螺旋）为例，分析其进化路径：

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  初始序列2-0（评分≈0）经E12位点突变（负电荷→正电荷）实现活性跃升

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  保守突变位点包括M5、A8、A25，其中A8经历三步突变（M→E→R）

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  实验测定路径所有序列MIC值与预测评分高度吻合（除2-7暂降）

  30天耐药性试验显示：环丙沙星（CIP）第8天即诱导耐药，而R04持续使用未引发耐药。

7 讨论与展望

AMPainter的创新性在于：统一了优化与生成双模式，突破序列设计空间限制（仅支持20种标准氨基酸单点替换），且进化路径可提供人工进化谱系（替代多重序列比对MSA）。当前局限包括：不支持插入/删除/非标准氨基酸操作，未整合毒性奖励（可结合ToxDL等预测器过滤）。未来需结合湿实验数据（如膜选择性测定）深化机制驱动设计。

8 实验方法精要

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  数据构建：HyperAMP训练集含3265条AMP（来源PepVAE）及等量非AMP，奖励分数通过公式 r_i=1/(1+10^logMIC_i-2) 转换

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  语言模型微调：Ankh-base在7316条非冗余AMP上微调（掩码率20%）

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  进化序列筛选：已知AMP选择MIC＞10μM者；SP去除含半胱氨酸/连续三同残基序列

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  MD模拟：CHARMM36m力场，500ns×3重复，膜模型按文献精确构建

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  活性测定：遵循Hancock法，浓度梯度0.125-128μM，终点法判读MIC