UHRF1通过抑制RFWD3调控DNA损伤修复过程中RAD51清除的时序机制

本研究发现UHRF1作为RFWD3的E3泛素连接酶，通过泛素化降解RFWD3来维持RAD51的稳定性，揭示了RAD51-UHRF1-RFWD3构成的负反馈调控环路。该机制通过CDK2/PP4调控的UHRF1磷酸化状态精确控制DNA损伤位点RAD51的清除时序，为同源重组修复（HR）的精准调控提供了新视角。

　　

Abstract

RAD51重组酶在进化上高度保守，对同源重组（HR）介导的DNA双链断裂修复至关重要。它通过与单链DNA结合形成蛋白-DNA丝状结构，在HR修复过程中执行同源搜索和配对功能。RFWD3作为一种E3泛素连接酶，被证实可通过RAD51的泛素化和降解在HR修复完成后清除RAD51。然而，在无DNA损伤状态和修复过程早期，是什么机制阻止RFWD3攻击RAD51仍不清楚。本研究揭示了UHRF1通过作为RFWD3的E3泛素连接酶来保护RAD51。有趣的是，RAD51也通过抑制UHRF1来保护RFWD3，由此形成了一个调控RFWD3和RAD51蛋白水平的负反馈环路。此外，研究还发现RFWD3的泛素化受UHRF1磷酸化状态的调控，而磷酸酶PP4对调节UHRF1活性具有重要作用。这些调控机制共同确保重组酶RAD51维持在适合HR修复的适当水平。

1 Introduction

UHRF1（ ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1）最著名的功能是维持基因组DNA的甲基化状态。它包含多个功能结构域：泛素样（UBL）结构域、串联Tudor结构域（TTD）、植物同源结构域（PHD）、SET和RING相关（SRA）结构域以及RING指结构域。TTD和PHD结构域是组蛋白阅读器，其中TTD识别异染色质标记组蛋白H3第9位赖氨酸三甲基化（H3K9me3），PHD则结合H3极端N末端的精氨酸2（R2）。SRA结构域识别半甲基化的CpG二核苷酸，RING指结构域具有E3活性可泛素化H3及其他底物。UBL结构域帮助组织这些功能模块并引入E2酶使RING指结构域发挥E3泛素连接酶功能。这些结构域协同工作，在复制期间或之后于基因组的半甲基化区域单泛素化组蛋白H3的K23和K18残基，生成DNMT1招募信号，随后被招募的DNMT1甲基化新生DNA链。

现已明确，UHRF1在DNA损伤和复制应激响应中也发挥重要作用。其各个结构域不仅在维持甲基化中具有功能，还在DNA损伤响应中起作用。SRA结构域可识别链间交联等DNA损伤，TTD结构域结合富集于DNA损伤位点的H3K9me3，帮助UHRF1招募至损伤位点。一旦到达损伤位点，其PHD结构域可能通过结合H3R2加强招募。UHRF1还与大量DNA损伤响应蛋白相互作用，包括BRCA1、XLF、PARP1等。其与BRCA1的相互作用通过驱离双链断裂处的RIF1来影响修复选择，使同源重组依赖的修复更受青睐。

RAD51重组酶是细菌RecA蛋白的同源物，在同源重组介导的DNA双链断裂修复中起关键作用。明确的是，RAD51与单链DNA（ssDNA）结合形成蛋白-DNA丝状结构，这是同源搜索和配对所必需的，是同源重组修复的关键步骤。该步骤完成后，RAD51通过泛素连接酶RFWD3的泛素化和蛋白酶体降解从DNA链上清除。然而，在HR过程早期和无DNA损伤状态下，是什么阻止RFWD3攻击RAD51仍完全不清楚。

维持RAD51蛋白水平很重要，因为我们最近发现了该重组酶在DNMT1维持基因组DNA甲基化中的新功能。这一功能需要对UHRF1进行双重调控：首先，RAD51直接抑制UHRF1介导的DNMT1多聚泛素化和降解；其次，RAD51结合组蛋白H3并将其呈递给UHRF1进行泛素化以生成DNMT1招募信号。RAD51缺陷导致DNMT1过度蛋白酶体降解及甲基转移酶招募至染色质失败，引起基因组DNA全局甲基化丢失。有趣的是，我们发现RAD51不仅直接相互作用并调控UHRF1，其自身表达也依赖UHRF1。本文报道UHRF1通过靶向RFWD3维持RAD51稳定性。损害UHRF1功能导致RFWD3蛋白酶体降解减少，从而增加该RAD51泛素连接酶的表达水平，引起RAD51过度泛素化和降解。然而，具有转折意义的是，作为RFWD3的猎物，RAD51实际上保护RFWD3免受UHRF1启动的泛素化和破坏。因此，这三个蛋白形成了一个负反馈环路，确保RFWD3和RAD51以适当表达水平在DNA损伤修复中发挥作用。此外，我们显示UHRF1在损伤位点保护RAD51免受RFWD3攻击中至关重要，并提供证据表明UHRF1的磷酸化状态也有助于阻止RFWD3过早降解RAD51。

2 Results

2.1 The Stability of RAD51 Depends on UHRF1

如我们之前报道，敲低UHRF1表达引起RAD51蛋白水平显著下调，但对转录无影响。这种下调可通过在UHRF1敲低细胞中使用蛋白酶体抑制剂MG132来阻止。另一方面，过表达UHRF1可增加RAD51蛋白水平。这些数据表明当UHRF1受损时，RAD51被泛素化并通过蛋白酶体降解。确实，在UHRF1敲低细胞中可观察到RAD51泛素化增强。为确定是UHRF1的泛素连接酶活性还是与RAD51的相互作用对维持RAD51稳定性是必需的，我们在敲低细胞中重新表达UHRF1。野生型UHRF1可恢复RAD51水平，不能与RAD51相互作用的突变体（UHRF1^5A）也能做到，表明UHRF1稳定RAD51不需要与重组酶相互作用。然而，泛素连接酶死亡突变体（UHRF1^CH2A）不能恢复RAD51水平。与此一致，野生型和5A突变体能阻止RAD51的过度多聚泛素化，而CH2A突变体不能。

鉴于UHRF1^CH2A不能稳定RAD51，我们推测UHRF1靶向另一个可泛素化RAD51降解的E3连接酶。当UHRF1敲低时，该E3上调并引起RAD51过度降解。除RFWD3外，整合素β-1抑制的RING1被报道可介导RAD51泛素化和降解。因此，RFWD3和RING1可能是UHRF1的靶标。或者，已报道的RAD51去泛素化酶UCHL3可能需要UHRF1以维持其表达，从而在没有UHRF1时其表达下调而不能去除RAD51上的多聚泛素链，导致重组酶被降解。我们因此检测了这些蛋白在UHRF1敲低细胞中的水平。结果显示，除RFWD3外，其他均不受UHRF1敲低影响。RFWD3在UHRF1敲低细胞中上调，提示RFWD3是UHRF1靶向的RAD51 E3连接酶。确实，当敲低RFWD3表达时，RAD51水平增加，而过表达该E3连接酶抑制RAD51水平。重要的是，UHRF1敲低引起的RAD51下调可在同时敲低UHRF1和RFWD3的细胞中被阻止，表明UHRF1通过调控RFWD3来稳定RAD51。此外，当UHRF1表达被敲低时，RFWD3变得稳定，同时RAD51变得不稳定。

为明确排除UHRF1介导RAD51泛素化以调控其稳定性的可能性，我们使用纯化蛋白进行了体外泛素化实验。结果显示，UHRF1容易自我泛素化，这种自我泛素化被GST-RAD51完全阻断。然而，在GST-RAD51上未检测到泛素化。因此，RAD51结合UHRF1并调控其针对DNMT1和RFWD3的E3活性，但其本身不是UHRF1的底物。

2.2 UHRF1 Regulates RFWD3

为证明UHRF1确实是RFWD3的E3，我们进行了泛素化实验。结果显示，敲低UHRF1减少RFWD3泛素化。进一步，使用仅能形成一种K连接类型的泛素突变体，显示RFWD3上的泛素修饰是K48连接的。免疫共沉淀实验也显示UHRF1和RFWD3之间存在相互作用，且该相互作用很可能是直接的，如GST pulldown实验所示。为确定UHRF1中RFWD3结合位点，我们生成了一系列截短的UHRF1蛋白，发现一旦C末端被删除，即使少至13个残基，与RFWD3的相互作用也被废除。UHRF1的最后3个残基是与RFWD3相互作用的位点。突变所有3个或3个中的2个，甚至仅最后一个残基，都会破坏与RFWD3的相互作用。为最小化对UHRF1功能的影响，我们使用N791A/R793A突变体（UHRF1^NR2A）进行实验。该突变体不能与RFWD3相互作用，也不能泛素化RFWD3，就像没有E3连接酶活性的UHRF1^CH2A一样。如预期，其表达导致RFWD3稳定和RAD51不稳定。

既然已在细胞基实验中确立UHRF1是RFWD3的E3，我们想确定UHRF1是否能在体外重构的泛素化反应中泛素化RFWD3，就像我们之前对DNMT1所做的那样。为此，我们从大肠杆菌表达和纯化了相关蛋白，并重构了泛素化反应。结果显示，UHRF1和UHRF1^5A都能泛素化RFWD3（使用催化失活的RFWD3^C315A作为底物以避免自身催化的泛素化），但不能与RFWD3相互作用的UHRF1^NR2A则不能。此外，UHRF1催化的泛素化可被RAD51阻断，但不能被不能与UHRF1相互作用的RAD51^R254Q阻断。总之，这些结果表明UHRF1在体内和体外都能作为RFWD3的E3。

由于RFWD3本身是一种E3连接酶，我们想知道它是否也能泛素化并抑制UHRF1表达作为回报。如上所示，敲低RFWD3不增加UHRF1水平。然后我们过表达RFWD3，但未检测到对UHRF1水平的影响，不像过表达UHRF1会降低RFWD3水平。总之，这些数据表明UHRF1单向调控RFWD3。

2.3 RAD51 Modulates UHRF1 in the Regulation of RFWD3

我们之前报道RAD51保护UHRF1的另一个底物DNMT1免于泛素化和降解。我们想知道RAD51是否对其自身的破坏者RFWD3做同样的事。确实，敲低RAD51引起约50%的RFWD3下调和该E3连接酶的不稳定，这可通过共敲低UHRF1或阻断蛋白酶体来挽救。此外，当RAD51被敲低时，重新表达野生型RAD51可挽救RFWD3水平，但不能与UHRF1相互作用的RAD51^R254Q突变体则不能。而且，在UHRF1敲低细胞中重新表达UHRF1^5A下调和 destabilized RFWD3。这里，不能与RFWD3相互作用的UHRF1^NR2A如预期上调RFWD3并下调RAD51。另一方面，过表达RAD51可如预期上调RFWD3，但过表达RAD51^R254Q不能。在这个实验中，我们还敲低了UHRF1和RAD51作为比较。确证的是，前者上调和后者下调RFWD3。这些数据表明RAD51抑制UHRF1介导的RFWD3泛素化和降解，很像它对DNMT1所做的那样。我们因此检测了在RAD51敲低及有或无重组酶重新表达的细胞中RFWD3上的泛素化水平。结果显示，敲低RAD51导致RFWD3泛素化增加，这被野生型RAD51重新表达所抑制，但不被RAD51^R254Q抑制，表明RAD51必须与UHRF1相互作用以发挥对RFWD3的保护作用。

我们接下来询问RAD51如何发挥这种保护。鉴于UHRF1中与RAD51相互作用的位点位于745-750残基之间，非常接近与RFWD3相互作用的位点（791和793之间），我们推测结合RAD51阻止UHRF1结合RFWD3。确实，敲低RAD51增强了UHRF1和RFWD3之间的相互作用，而过表达则减弱了该相互作用。如预期，过表达不能与UHRF1相互作用的RAD51^R254Q不能做到这一点。体外GST pulldown实验也证明RAD51能驱离RFWD3与UHRF1相互作用，但RAD51^R254Q不能。进一步，使用纯化的RAD51（His-RAD51）来pulldown RFWD3和UHRF1，我们看到RAD51和UHRF1之间的强相互作用不受增加RFWD3量的影响。在297T细胞中转染获得了类似结果。另一方面，敲低RFWD3不改变UHRF1和RAD51之间的相互作用，表明RFWD3不影响UHRF1与RAD51的结合。这些数据表明UHRF1结合RAD51比结合RFWD3强得多，且RAD51能驱离RFWD3与UHRF1分离，但RFWD3不能对RAD51做同样的事。

总之，这些结果证明了UHRF1、RFWD3和RAD51之间的三重负反馈环路，确保细胞中维持适当水平的RAD51和RFWD3。

2.4 The Ubiquitination of RFWD3 is Regulated by the Phosphorylation Status of UHRF1

之前报道UHRF1在细胞周期S和M期被细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）磷酸化。两个CDK共识磷酸化位点（Ser639和Ser661，在亚型1上：NP_001276981.1）被报道在S期（S661）和M期（S639）被磷酸化。S661磷酸化对UHRF1与BRCA1的相互作用是必需的，并参与修复途径选择，而S639磷酸化介导与USP7的相互作用。斑马鱼UHRF1等效S661位点的磷酸化对发育至关重要。我们因此想知道S661磷酸化是否影响UHRF1-RFWD3-RAD51轴。我们表达了UHRF1、UHRF1^S661A和UHRF1^S661D，并检测了三者之间的相互作用。结果显示，不可磷酸化的UHRF1突变蛋白（S661A）与RFWD3相互作用较少，但与RAD51相互作用较多，与野生型蛋白相比。另一方面，磷酸化模拟突变体（S661D）行为正好相反，与RFWD3相互作用更多，与RAD51相互作用更少。因此，Ser661磷酸化确实影响UHRF1与其猎物RFWD3以及其抑制剂RAD51的相互作用。这一结果预测UHRF1磷酸化越多，RFWD3泛素化和降解越多。确实，UHRF1^S661D促进RFWD3泛素化，而UHRF1^S661A不能。结果，我们可在UHRF1^S661D表达细胞中看到RFWD3水平减少。

UHRF1的磷酸化可能除了影响两者之间的相互作用外，还变构影响其针对RFWD3的E3活性。为查明是否如此，我们表达和纯化了UHRF1（WT、S661A和S661D）并进行了体外泛素化实验。很明显，S661的状态对UHRF1的E3活性影响很小，无论是针对自身还是针对RFWD3。使用催化失活的RFWD3突变体（C315A）作为底物以避免RFWD3自我泛素化。

为进一步证明磷酸化调控UHRF1，我们用选择性CDK2抑制剂（CDK2i）CDK2-IN-4处理U2OS细胞以阻断UHRF1磷酸化，然后检测对RFWD3表达的影响。结果显示，CDK2i能以UHRF1依赖的方式上调RFWD3蛋白水平。该抑制剂还延长了RFWD3的半衰期。此外，我们构建了细胞周期蛋白D1和CDK2的融合（CCND1-CDK2）以使CDK2组成型活化如报道所述。表达该融合蛋白导致RFWD3下调，并能克服CDK2i对RFWD3的影响，提示我们使用的CDK2i通过CDK2起作用，而不是通过其他CDKs如CDK1。总之，这些数据强有力支持UHRF1在S661被CDK2磷酸化增强其与RFWD3的相互作用和泛素化介导的后者降解的观点。

接下来，我们想确定哪种磷酸酶负责去磷酸化UHRF1。之前他人的工作提示CDC14A、CDC14B和蛋白磷酸酶4（PP4）作为撤销CDK磷酸化的磷酸酶。我们因此敲低它们并检测RFWD3表达水平。结果发现，只有敲低PP4C（PP4的催化亚基）表达导致RFWD3下调。这种下调可通过敲低PP4的调节亚基PP4R3A来模拟，并可通过同时敲低UHRF1和PP4R3A来挽救。如预期，当PP4C被敲低时，UHRF1磷酸化增加，UHRF1和RFWD3之间的相互作用也增加。进一步，我们可检测到UHRF1和PP4R3A之间的相互作用，而未能检测到PP4R3A和RFWD3之间的相互作用。

确立PP4作为UHRF1的磷酸酶后，我们想确定UHRF1中与PP4相互作用的位点。据报道PP4（通过其调节亚基R3A）结合其底物的FxxP基序。UHRF1包含2个这样的基序，FASP（残基637-640）和FSCP（残基757-760）。我们突变这两个基序（FASP变为AASA，FSCP变为ASCA）并检测它们的磷酸化。只有第一个基序（FASP）对磷酸化似乎重要。突变它也废除了UHRF1和PP4R3A之间的相互作用，但增强了UHRF1和RFWD3之间的相互作用，因为该突变体不能再被去磷酸化。与这些观察一致，该突变体（UHRF1^FP2A）能够下调RFWD3。我们进一步用有效的PP4抑制剂fostriecin处理U2OS细胞。该处理 destabilized RFWD3，与CDK2i的效果相反。抑制PP4也增加UHRF1磷酸化，再次与CDK2i处理相反。

UHRF1的各种相互作用伙伴以及本文报道和鉴定的相互作用位点如图所示。

2.5 UHRF1 Protects RAD51 at DNA Damage Sites

已知RFWD3在同源重组过程结束时从DNA上清除RAD51。是什么阻止它在RAD51完成链搜索和配对之前这样做是未知的。根据我们目前获得的结果，可以合理假设是UHRF1抑制了RFWD3。为证明这一点，我们检测了用丝裂霉素（MMC）处理1小时然后释放的细胞中RFWD3在损伤位点的动力学。MMC处理导致大量DNA损伤位点，可通过γH2AX的免疫荧光染色可视化。随着细胞从MMC处理中释放，染色减少。如预期，RFWD3在整个MMC处理和释放过程中与γH2AX共染色。这些细胞敲低了UHRF1但补充了外源性UHRF1、UHRF1^5A或UHRF1^NR2A。MMC处理后立即，在对照细胞中可容易检测到RFWD3焦点，但在UHRF1敲低细胞中几乎检测不到。对RAD51也是如此。这并不意外，因为UHRF1识别链间交联（ICL）损伤并激活Fanconi通路，并且RPA（复制蛋白A）招募RFWD3至DNA损伤位点。虽然重新表达野生型UHRF1如预期恢复了RFWD3焦点，但重新表达UHRF1^5A不能，很可能因为该突变体导致过量RFWD3降解。这引起RAD51焦点在UHRF1^5A表达细胞中持续存在，证实了之前RAD51被RFWD3清除的报道。值得注意的是，UHRF1^5A没有明显增加RAD51的总水平。而且，在重新表达不能与RFWD3相互作用的UHRF1^NR2A的细胞中，RFWD3焦点不仅被恢复，而且比其他细胞中停留得久得多，这强烈提示UHRF1功能是抑制RFWD3在损伤位点。在这些细胞中，即使在释放时也几乎检测不到RAD51焦点，这很可能是这些细胞中RAD51水平从一开始就减少的结果。

由于CDK2介导的UHRF1磷酸化调控其与RFWD3的相互作用，我们想知道这种磷酸化是否在保护RAD51免受RFWD3攻击中起作用。为此，我们在1小时MMC处理释放开始时立即添加CDK2i，并检测RFWD3和RAD51焦点的动力学。很明显，抑制CDK2导致与表达UHRF1^NR2A非常相似的RFWD3动力学。更重要的是，在这些条件下，RAD51焦点在释放开始时在对照和CDK2i处理的细胞中是相同的（它们应该如此），但随着时间的推移，很明显RAD51焦点在CDK2i处理的细胞中比在对照细胞中消失得快得多。相反，在MMC处理释放开始时添加PP4i引起RFWD3焦点过早消失和RAD51清除减慢。这些结果强有力地证明是磷酸化的UHRF1通过抑制损伤位点的RFWD3来保护RAD51。阻断UHRF1磷酸化导致更高水平的RFWD3和随之而来的RAD51过早降解，而增强UHRF1磷酸化（通过抑制PP4）导致RFWD3过度降解和RAD51清除延迟。

使用相同策略（敲低UHRF1并重新表达UHRF1野生型或突变体），我们检测了用羟基脲（HU，2 mM）处理24小时然后释放的U2OS细胞中RFWD3在DNA损伤位点的动力学。获得了与MMC处理并释放的细胞非常相似的结果。

确立UHRF1在控制RFWD3中的关键作用后，我们接下来想确定破坏这种作用是否会干扰HR修复。我们因此利用HR报告细胞系U2OS/GFP-DR。我们敲低UHRF1并在这些细胞中重新表达野生型或突变型UHRF1。结果显示，敲低UHRF1降低HR效率约50%，重新表达野生型UHRF1恢复HR效率。有趣的是，重新表达UHRF1^5A增加HR效率约25%，与重新表达野生型UHRF1的细胞相比。这是可理解的，因为RAD51在UHRF1^5A表达细胞中在损伤位点停留更久。不出所料，重新表达UHRF1^NR2A完全不能恢复HR效率，很可能因为RAD51被增加的RFWD3存在过早地从损伤位点清除。

3 Discussion

同源重组介导的双链断裂修复对基因组稳定性至关重要。它是一个多步骤过程，需要大量蛋白以协调方式共同工作。在该过程的最后几步，RAD51被加载到单链DNA上形成蛋白-DNA丝状结构用于链侵入和与同源序列配对，之后被RFWD3介导的泛素化清除。然而，不清楚是什么阻止RFWD3在同源搜索和配对之前这样做。这里我们提供强有力证据支持是UHRF1，一种E3泛素连接酶本身，抑制RFWD3。没有这种抑制，RAD51被过早清除。我们相信这种抑制通过CDK2和PP4对UHRF1磷酸化的作用被动态调控。除此之外，CDK2和PP4可能被调控以实现UHRF1活性的微调。

自2002年首次报道Uhrf1缺陷的小鼠胚胎干细胞对DNA损伤剂和复制阻断敏感以来，UHRF1在DNA损伤和复制应激响应中的作用已被广泛研究。这些研究揭示了许多在DNA损伤响应途径中起作用的UHRF1相互作用伙伴，包括BRCA1。我们最近显示UHRF1直接与另一个DNA响应核心蛋白RAD51相互作用，并证明了这种相互作用在维持DNA甲基化中的重要性。本文显示这种相互作用也涉及DNA损伤修复，因为该相互作用帮助维持RFWD3的蛋白水平，另一个E3连接酶 heavily involved in DNA损伤和复制应激响应。具有讽刺意味的是，RAD51，RFWD3的一个底物，保护其自身的破坏者免于被UHRF1破坏，导致一个三重负反馈环路。我们提供充分证据表明该调控环路在未受干扰细胞以及受损细胞中维持RAD51和RFWD3水平很重要。在DNA损伤位点，该调控环路很可能被几个因素复杂化。首先，UHRF1很可能结合组蛋白H3，我们知道H3结合排除RAD51与UHRF1相互作用。其次，在链间交联的情况下，UHRF1直接结合损伤，这可能影响UHRF1与RAD51相互作用或泛素化RFWD3的能力。尽管有这些，然而，必须有游离的UHRF1分子需要被RAD51抑制，否则我们不会看到UHRF1^5A对RFWD3的影响。此外，RFWD3通过相互作用与RPA被招募至DNA损伤位点。与RPA的相互作用是否影响UHRF1对RFWD3的调控或RFWD3对RAD51的调控仍有待确定。

越来越认识到细胞周期蛋白依赖性激酶，尤其是CDK2，在DNA损伤响应（DDR）中起重要作用。据报道，在Cdk2^-/-