环状RNA circSMPD4通过乳酸代谢重编程介导肝癌天然免疫逃逸的机制研究

本文揭示了环状RNA circSMPD4在肝细胞癌（HCC）中通过结合乳酸脱氢酶A（LDHA）并促进其去乙酰化，抑制分子伴侣介导的自噬（CMA）途径降解，进而增强肿瘤细胞糖酵解和乳酸代谢，诱导自然杀伤（NK）细胞功能抑制和免疫逃逸的分子机制。研究为HCC免疫治疗提供了新靶点和理论依据。

　　

1 引言

肝细胞癌（HCC）是全球健康的重要威胁，其发病率和死亡率逐年上升。尽管综合治疗策略有所进展，晚期HCC的预后仍然较差。免疫逃逸是导致HCC预后不良的关键因素之一，深入研究其机制对改善HCC的治疗和预后具有重要意义。自然杀伤（NK）细胞作为天然免疫的核心效应细胞，在肝脏中富集，占肝内淋巴细胞的25%–40%，在肝脏病理生理学中扮演关键角色。肿瘤细胞通过代谢重编程适应营养缺乏、代谢废物丰富的肿瘤微环境（TME），其中Warburg效应（即有氧糖酵解）是典型代表，其特征是糖酵解增加和线粒体氧化代谢减少，形成免疫抑制的高乳酸TME。乳酸脱氢酶A（LDHA）是乳酸代谢关键酶的主要亚基，其在多种肿瘤组织中表达升高，与不良预后相关。环状RNA（circRNA）是一类共价闭合的单链RNA，具有高稳定性和组织特异性表达的特点，在肿瘤发展和进展中发挥重要调控作用。

2 结果

2.1 CircSMPD4的鉴定及其在NK细胞驱动的HCC演化中的免疫抑制和致癌作用

通过体外NK细胞驱动的肿瘤演化模型，建立了NK细胞抵抗的肿瘤细胞（NK-R细胞），并通过转录组测序和circRNA微阵列分析，发现circSMPD4（hsa_circ_0092297）在NK-R细胞中显著上调。circSMPD4的环状结构通过反向引物和Sanger测序验证，其表达从正常肝细胞到野生型肿瘤细胞再到高恶性NK-R细胞呈渐进式上调，表明其在肿瘤演化和免疫逃逸中的潜在重要性。

2.2 CircSMPD4表达升高与HCC不良临床结局相关

在18对HCC组织样本中，circSMPD4在癌组织中的表达显著高于癌旁组织。此外，在高侵袭性（HI）HCC组织和NK细胞抵抗（NKR）的HCC组织中，circSMPD4表达均上调。临床随访数据显示，circSMPD4高表达与患者总生存期和疾病无进展生存期缩短显著相关。

2.3 CircSMPD4介导对NK细胞细胞毒性的抵抗

通过慢病毒介导的过表达和敲低策略，调控circSMPD4的表达，发现circSMPD4敲低显著增强肿瘤细胞对NK细胞介导的细胞毒性的敏感性，而过表达则相反。这表明circSMPD4在介导免疫逃逸中发挥关键作用。

2.4 CircSMPD4增强HCC中与肿瘤恶性相关的生物学行为

体外实验表明，circSMPD4促进肿瘤细胞迁移、增殖和侵袭。体内实验通过原位移植瘤模型和尾静脉注射转移模型，发现circSMPD4敲低显著抑制肿瘤生长和转移，并延长小鼠生存期。这表明circSMPD4具有促进肿瘤进展的功能。

2.5 CircSMPD4通过增强Warburg效应间接损害NK细胞功能

通过直接和间接共培养实验，发现circSMPD4通过调节肿瘤细胞代谢，特别是糖酵解和乳酸代谢，间接抑制NK细胞功能。代谢组学分析显示，circSMPD4敲低导致乳酸水平下降，而过表达则增加乳酸产生。外源性乳酸处理可逆转circSMPD4敲低导致的NK细胞毒性增加，表明乳酸是circSMPD4介导免疫抑制的关键代谢物。

2.6 LDHA：与CircSMPD4功能相关的关键相互作用蛋白

CircSMPD4主要定位于细胞质，通过RNA pull-down和质谱分析，发现LDHA是circSMPD4的结合蛋白。CircSMPD4特异性调节LDHA表达，而不影响其他糖酵解酶。进一步实验验证了circSMPD4与LDHA的物理相互作用，且LDHA表达与HCC预后负相关。

2.7 CircSMPD4的生物学功能依赖LDHA

通过LDHA的过表达和敲低实验，发现LDHA可逆转circSMPD4对乳酸产生、糖酵解能力和NK细胞细胞毒性的影响。体内实验显示，LDHA过表达可恢复circSMPD4敲低导致的肿瘤生长抑制和乳酸水平下降，表明LDHA是circSMPD4功能的核心效应器。

2.8 CircSMPD4通过CMA途径抑制LDHA降解

蛋白质降解实验表明，circSMPD4敲低加速LDHA降解，缩短其半衰期。进一步机制研究发现，circSMPD4通过抑制分子伴侣介导的自噬（CMA）途径阻止LDHA降解。LAMP2A敲低可逆转circSMPD4敲低导致的LDHA下调，且circSMPD4抑制LDHA与HSC70的结合。

2.9 CircSMPD4通过促进SIRT2介导的LDHA去乙酰化抑制其降解

CircSMPD4敲低增加LDHA的乙酰化水平，而去乙酰化酶抑制剂尼古酰胺（NAM）处理可模拟这一效应。SIRT2作为LDHA的去乙酰化酶，其过表达可逆转circSMPD4敲低导致的LDHA乙酰化增加和降解加速。CircSMPD4通过与LDHA和SIRT2物理结合，促进LDHA去乙酰化，从而抑制其CMA介导的降解。

2.10 CircSMPD4与LDHA C末端的相互作用对其生物学功能至关重要

通过分子模拟和突变实验，发现circSMPD4的67–72、86–90和478–484核苷酸区域以及LDHA的C末端结构域对其相互作用和功能至关重要。LDHA C末端缺失突变体无法恢复circSMPD4的功能，表明其结合是circSMPD4发挥生物学效应的关键。

3 讨论

本研究通过NK细胞驱动的肿瘤演化模型，鉴定了一个新的致癌circRNA——circSMPD4，其在HCC中通过调节乳酸代谢重编程，促进免疫逃逸和肿瘤进展。机制上，circSMPD4通过与LDHA和SIRT2物理结合，促进LDHA去乙酰化，抑制其CMA途径降解，从而增强Warburg效应和乳酸产生，间接抑制NK细胞功能。研究为HCC的免疫治疗提供了新的靶点和理论依据。

4 实验方法

研究使用了4个独立的HCC患者队列，包括100例患者样本。通过体外肿瘤演化模型、细胞培养、分子生物学实验、动物模型等多种方法，全面验证了circSMPD4的功能和机制。所有实验均遵循相关伦理规范。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金、浙江省自然科学基金等多个项目的资助。

利益冲突

作者声明无利益冲突。

作者贡献

H.S.、B.L.和J.H.对本研究贡献相等。H.S.、X.C.、L.S.和Y.W.设计了研究。H.S.完成了大部分生化分子实验，B.L.、J.H.等人提供了协助。J.H.进行了生物信息学分析。B.L.和W.Z.收集并提供了临床样本和数据。H.S.和B.L.撰写了论文，L.S.和Y.W.进行了修订。