微凝胶长径比调控可注射颗粒水凝胶支架孔隙结构与细胞浸润促进组织修复

本研究发现高长径比（AR）棒状微凝胶构建的颗粒水凝胶具有显著增大的孔隙体积分数（>50%）和孔径尺寸（中位值>50 μm），通过体外内皮细胞球出芽实验和皮下注射大鼠模型证实其显著促进细胞迁移和浸润（位移提升>50%）。该研究首次将高AR（AR5）微凝胶应用于心肌梗死（MI）大鼠模型，证实其可减少梗死面积（降低约10%）并改善心功能（射血分数EF提高>10%），为设计可注射组织工程支架提供了创新性策略。

　　

1 引言

颗粒水凝胶通过水凝胶微粒（即微凝胶）组装而成，因其模块化特性、可注射性以及调控孔隙体积分数和孔径尺寸的独特能力，在组织工程领域获得广泛应用。传统研究主要集中于球形微凝胶，其对颗粒水凝胶孔径和孔隙体积分数的控制有限。近年来，高长径比微凝胶的研究显示出实现更高孔隙率的潜力。本研究旨在探讨透明质酸微凝胶长径比（3至5）对颗粒水凝胶孔隙结构和细胞相互作用的影响。

2 结果

2.1 微凝胶与颗粒水凝胶支架的制备

采用微流控技术合成降冰片烯修饰透明质酸（NorHA）微凝胶。通过调节分散相与连续相的流速比，成功制备出长径比约3、4、5的棒状微凝胶（分别记为AR3、AR4、AR5）及其体积匹配的球形微凝胶。棒状微凝胶的平均直径介于68±5至107±8 μm之间，球形微凝胶的等效直径介于129±12至172±12 μm之间。所有微凝胶均掺入FITC-葡聚糖用于荧光显微镜观察。

Cinema4D刚体动力学模拟显示，与体积匹配的球形微凝胶相比，棒状微凝胶组装的颗粒水凝胶具有更高的孔隙体积分数（棒状：42.1±0.1%至47.7±0.1%；球形：32.6±0.4%至37±0.1%），这与随机棒状粒子堆积的理论预测一致。

2.2 微凝胶支架孔隙空间与孔径随长径比增加而增大

通过离心法将微凝胶压紧成颗粒水凝胶，并采用共聚焦显微镜成像。利用LOVAMAP软件对三维孔隙结构进行分析，发现所有棒状微凝胶组装的颗粒水凝胶孔隙体积分数均高于体积匹配的球形微凝胶（棒状：52.8±1.8%至69.8±6.5%；球形：24.8±6.2%至45.8±6.9%）。双因素方差分析表明，微凝胶形状和长径比均对孔隙体积分数有显著影响。

棒状微凝胶组装的颗粒水凝胶其孔隙的平均内径更大（51至67 μm），而球形微凝胶组装的支架孔隙平均内径较小（36至45 μm）。棒状微凝胶支架的孔隙末端长度也更长（139至172 μm），但孔隙长径比反而低于球形微凝胶支架，这可能与棒状微凝胶局部排列导致孔隙形状更宽有关。

2.3 高长径比微凝胶促进细胞向颗粒水凝胶支架内出芽

通过将人脐静脉内皮细胞与人间充质基质细胞形成的球状体嵌入颗粒水凝胶中进行三维培养，评估细胞出芽情况。培养3天后，共聚焦显微镜观察显示，高长径比（AR4和AR5）棒状微凝胶组装的颗粒水凝胶支持细胞出芽的位移显著增加（215±53至190±39 μm），且曲折度降低。出芽位移与支架孔隙体积分数呈正相关（R²=0.404），表明孔隙体积分数是影响细胞浸润的关键因素。

2.4 颗粒水凝胶的流动性与可注射性

流变学测试表明，棒状微凝胶组装的颗粒水凝胶储能模量（G′）低于球形微凝胶（棒状：100–300 Pa；球形：200–500 Pa），这与其较高的孔隙率和含水量有关。通过27G针头注射所需的力小于2 N，在可接受范围内。共聚焦显微镜观察显示，棒状微凝胶在毛细管中流动时沿流动方向排列，而球形微凝胶因直径变异增加了流动阻力。

将微凝胶注射到明胶水凝胶中模拟受限空间内的堆积，发现所有组的孔隙体积分数均下降，但棒状微凝胶仍保持更高的孔隙体积分数（12.6±2%至23.5±5.7%），表明其在注射后仍能维持有利的孔隙结构。

2.5 高长径比棒状微凝胶促进体内细胞侵袭

将颗粒水凝胶注射到大鼠皮下，1周后分析显示，高长径比棒状微凝胶组装的支架孔隙空间（如AR5棒状：34.6±7.1%）和细胞侵袭面积（如AR5棒状：12.8±3.9%）均高于球形微凝胶。这表明棒状微凝胶在体内也能有效促进细胞浸润。

2.6 高长径比微凝胶颗粒水凝胶改善心肌梗死后的修复

在大鼠心肌缺血再灌注模型中，于再灌注后立即向心肌内注射AR5棒状微凝胶（总量100 μL）。4周后，组织学分析显示，治疗组梗死面积减小（棒状微凝胶组：18.7±8.1%；对照组：28.4±8.5%），纤维化面积有减小趋势。超声心动图显示，治疗组心功能指标显著改善，包括射血分数（EF）、缩短分数（FS）和左室壁厚度（LVWT）均优于对照组。免疫组化分析显示，治疗组梗死区域CD31⁺和αSMA⁺共染的血管结构增多，表明血管生成增强。

3 讨论

本研究证实，高长径比棒状微凝胶能显著提高颗粒水凝胶的孔隙体积分数和孔径，从而促进细胞迁移和浸润。棒状微凝胶还表现出良好的可注射性和体内保留性，使其适合作为组织工程支架。首次将高AR微凝胶应用于心肌梗死治疗，并显示出减少梗死面积和改善心功能的效果，为心脏组织修复提供了新的策略。

本研究结果不仅适用于心脏修复，还可推广至其他组织工程领域。未来可进一步探索微凝胶刚度、交联密度以及添加细胞因子或药物对支架性能的优化作用。

4 实验方法

微凝胶采用微流控技术合成，NorHA通过TBA盐法进行降冰片烯修饰。棒状与球形微凝胶通过调节流控参数控制尺寸与形状。颗粒水凝胶通过离心（15 000 rcf，5 min）制备。孔隙结构采用共聚焦显微镜成像并通过LOVAMAP软件分析。流变学性能采用旋转流变仪测定。体外细胞出芽实验采用内皮细胞/间充质细胞球状体包埋模型。体内实验采用大鼠皮下注射模型和心肌缺血再灌注模型，并通过组织学、免疫组化和超声心动图进行评估。统计数据采用GraphPad Prism软件进行方差分析。