新生儿期短暂性甲状腺功能减退对大鼠青春期前睾丸发育及未分化精原细胞的影响：聚焦精原干细胞动态与机制

本文探讨了新生儿期短暂性与持续性甲状腺功能减退对大鼠青春期前睾丸发育的影响，重点关注了精原干细胞（SSCs）的动态变化。研究通过建立两种PTU诱导的大鼠模型，结合血清激素检测与组织免疫染色（GFRA1、DDX4、SOX9、Ki-67），发现即使低剂量短暂性甲减也可显著增加未分化生殖细胞（含SSCs）数量，并延缓生精小管管腔形成。该模型为研究早期甲状腺激素失衡对生殖细胞库建立的影响提供了重要平台。

　　

引言

精子发生是一个复杂且持续的过程，始于青春期之后，其起源为精原干细胞（SSCs）。SSCs在婴儿期由性原细胞分化而来，其数量与未来的精子计数密切相关，因此在生育力方面具有重要意义。然而，调控SSCs从性原细胞分化与增殖的机制仍不完全清楚。

甲状腺激素在睾丸发育中扮演关键角色，特别是在调节支持细胞（Sertoli细胞）的增殖与分化方面。先天性甲状腺功能减退症（CH）是一种常见的新生儿内分泌疾病，早期治疗通常能保证正常的青春期发育和性腺功能。但关于在新生儿期接受治疗的CH患者早期睾丸发育如何受到影响，以及对生殖细胞群体初始建立的影响，目前知之甚少。

为了研究生命早期甲状腺功能减退对睾丸发育的影响，特别是对未分化精原细胞（可能包括SSCs）的影响，本研究建立了两种新生大鼠模型：持续性甲状腺功能减退（cHT）模型和仅限于新生儿期的短暂性甲状腺功能减退（tHT）模型。

材料与方法

本研究使用怀孕的Sprague-Dawley（SD）大鼠，通过给哺乳期母鼠口服不同浓度（0.001%、0.001%、0.03%）的6-正丙基-2-硫尿嘧啶（PTU）来诱导雄性后代出现甲状腺功能减退。cHT模型从出生后持续给予PTU直至 postnatal day 20（PND20），而tHT模型仅在出生后至PND7期间给予PTU，之后改喂普通水。

在PND7、10和20收集血清和睾丸组织。使用Luminex MAGPIX系统检测血清中的甲状腺素（T4）、三碘甲状腺原氨酸（T3）、促甲状腺激素（TSH）、卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）水平。睾丸组织进行石蜡包埋和切片，用于苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组织化学分析。

使用的抗体包括：抗DDX4（生殖细胞标志物）、抗GFRA1（未分化精原细胞/SSCs标志物）、抗SOX9（Sertoli细胞标志物）和抗Ki-67（细胞增殖标志物）。通过免疫荧光双染（GFRA1和Ki-67）评估未分化精原细胞的增殖状态。对生精小管短径、各种阳性细胞数量进行了定量分析。所有统计分析使用EZR软件完成，采用Mann-Whitney U检验，显著性水平设为p < 0.05。

结果

持续性甲状腺功能减退（cHT）模型的结果

在cHT模型中，三个PTU处理组在PND20的体重、睾丸重量及睾丸/体重比均显著低于对照组。0.03% PTU组出现了死亡案例。血清T4水平在所有时间点均显著降低；T3水平在0.01%和0.03% PTU组的PND20降低；而TSH水平在整个研究期间均显著升高。组织学分析显示，在PND20，PTU处理组的生精小管没有管腔形成，直径显著减小，间质区域扩大。DDX4阳性细胞数量减少，但由于发育阶段差异巨大，对GFRA1和SOX9进行定量比较并不合适。

短暂性甲状腺功能减退（tHT）模型的结果

在tHT模型中，各处理组的体重在所有时间点与对照组无显著差异。睾丸重量和睾丸/体重比在PND7和PND10无差异，但在PND20显著低于对照组。血清T4水平在所有PTU组均显著降低；T3水平在PND10的0.01%和0.03% PTU组降低，但在PND20恢复正常；TSH水平在PND7和PND10升高，到PND20则恢复正常。血清FSH水平在PND10的0.01% PTU组暂时性降低，LH水平无显著变化。这些结果表明tHT模型成功诱导了短暂性甲减状态，且全身性影响最小。

组织学分析显示，在PND7，所有组的生精小管结构未见显著改变，但随着PTU浓度增加，小管直径变窄，周围间质区域变宽。免疫染色显示，与对照组相比，PTU处理组的DDX4和GFRA1阳性细胞数量增加，而SOX9阳性细胞数量无差异。在PND20，所有组均观察到生精小管管腔结构，但其发育程度呈剂量依赖性降低。PTU处理组的生精小管直径更小。DDX4阳性细胞（接触基底膜）和GFRA1阳性细胞数量显著增加，SOX9阳性细胞数量仍无差异。

定量分析证实，在PND7和PND20，PTU处理组的生精小管直径显著减小。在PND7，所有PTU组的DDX4和GFRA1阳性细胞数量均增加；在PND20，所有PTU组的DDX4阳性细胞数量增加，0.01%和0.03% PTU组的GFRA1阳性细胞数量增加。SOX9阳性细胞数量在两个时间点均无组间差异。

此外，在tHT模型（0.01% PTU组）的PND7睾丸中，通过GFRA1/Ki-67双标免疫荧光发现，一些GFRA1阳性细胞的细胞核内存在Ki-67阳性核仁，表明这部分未分化精原细胞处于活跃增殖状态。

讨论

本研究利用cHT和tHT两种实验模型，探讨了新生儿甲状腺功能减退对睾丸组织的影响。cHT模型虽然成功诱导了甲减，但引起了显著的全身性发育迟缓，这掩盖了睾丸特异性的发现，使其难以用于评估甲状腺功能与睾丸发育间的特定关系。

相比之下，tHT模型仅在新生儿期诱导短暂的甲减，到PND20时甲状腺功能基本恢复正常，且未引起显著的全身性影响（如体重变化）。这使其成为一个理想的模型，用于特异性研究短暂性甲减对睾丸发育的影响，尤其适用于模拟临床上经治疗的新生儿CH情况。

本研究最重要的发现是，即使在极低剂量（0.001% PTU）和短暂的甲减干预下，也能显著增加未分化精原细胞（DDX4和GFRA1阳性）的数量，这部分细胞很可能包含了SSCs。同时，双标实验证实这些细胞处于增殖状态。另一方面，Sertoli细胞（SOX9阳性）的数量并未发生改变，这与一些在更晚时间点发现Sertoli细胞数量增加的既往研究不同，可能与本研究的观察时间点较早（PND20之前）有关。

生精小管管腔的形成是小管成熟的一个标志。本研究观察到PTU处理延缓了管腔的形成，且效果呈剂量依赖性，这表明甲减状态延迟了睾丸的形态发生和成熟过程。

从机制上讲，甲状腺激素通过其受体TRα1作用于Sertoli细胞细胞核，抑制其增殖并促进其功能成熟。因此，甲减理论上会延长Sertoli细胞的增殖期，从而增加其最终数量，并为更多的生殖细胞提供支持 niche，这可能是导致成年后精子数量增加的原因。本研究在新生儿期观察到的未分化生殖细胞数量的增加，可能是上述成年期现象的早期细胞基础。

关于激素水平，值得注意的是，即使0.001%的极低PTU剂量也足以引起显著的T4降低和TSH升高，诱导出甲减状态。T3水平的变化则呈现动态补偿的特点。此外，在PND10观察到的短暂性FSH水平下降其机制和意义有待进一步研究。

结论

本研究证明，新生儿期短暂且低程度的甲状腺激素 insufficiency，即可显著增加大鼠青春期前睾丸中未分化精原细胞（可能包括精原干细胞SSCs）的数量，并延缓生精小管的成熟。所建立的短暂性甲减（tHT）模型全身影响小，为在关键发育时间窗内，研究早期甲状腺激素失衡如何影响生殖细胞群体建立提供了一个生理相关且微创的研究平台。该模型尤其适用于模拟经治疗的先天性甲状腺功能减退症的临床场景，对未来研究生殖内分泌疾病的发生机制和干预策略具有重要意义。