Pten单倍剂量不足模型揭示自闭症谱系障碍中体感神经元发育异常的机制

本文推荐一篇关于自闭症谱系障碍（ASD）发病机制的研究论文，作者通过Pten杂合（PtenHet）小鼠模型，揭示PTEN（Phosphatase and tensin homolog）信号通路在初级体感神经元发育中的关键作用。研究显示Pten单倍剂量不足导致背根神经节（DRG）神经元亚型分化异常，涉及mTOR和GSK-3β信号通路的失调，为ASD感觉异常提供了发育机制层面的新见解。

　　

引言

自闭症谱系障碍（ASD）是一种复杂的神经发育障碍，其临床特征包括社交互动缺陷、重复行为以及对感觉刺激的超敏或低敏。尽管感觉异常在ASD中十分常见，但其细胞机制尚未完全阐明。近年来，在ASD啮齿类模型中的研究发现，负责将体感信息传递至中枢神经系统的背根神经节（DRG）神经元存在差异。然而，ASD相关的DRG神经元改变在发育过程中如何产生，以及这些表型在不同ASD模型中是否保守，仍属未知。

本研究以Pten（ phosphatase and tensin homolog）杂合小鼠（Pten^Het）作为综合征型ASD的模型，并鉴定出其对感觉刺激的反应存在改变。通过转录组学和体内分析，研究者在Pten^Het小鼠中发现了DRG神经元亚型特异性标志物的改变，这些变化出现于DRG发育早期，并涉及PTEN下游信号通路的失调。最后，研究证明携带ASD相关突变（Pten^Y68H）的小鼠表现出几乎相同的体感神经元亚型特异性标志物表达改变。这些结果表明，精确的PTEN水平对正常的体感发育是必需的，并为综合征型ASD模型中感觉异常的分子和细胞基础提供了新的认识。

材料与方法

所有实验均经俄勒冈健康与科学大学机构动物护理和使用委员会批准。小鼠在标准条件下饲养，Pten杂合雄性育种鼠（B6;129P2-Pten^tm1Mak/Mmjax）与CD1雌性交配，以产生混合遗传背景的实验小鼠。对于患者特异性Y68H Pten突变的相关表型，使用Pten^Y68H/+雄性育种鼠。所有动物按同窝出生分组饲养，并在混合遗传背景下维持。两性小鼠均用于实验，野生型同窝小鼠用作对照。

行为测试包括旋转棒实验、胶带移除实验、油滴实验、Von Frey实验以及热伤害感受实验，分别用于评估感觉运动协调、触觉-运动整合、C-LTMR介导的机械感觉、机械敏感性和热伤害感受。组织处理和RNA测序则包括从成年Pten^Het和野生型同窝对照小鼠中分离全DRG，进行RNA提取、测序及生物信息学分析。

结果

Pten单倍剂量不足导致体感行为缺陷

在加速旋转棒实验中，雄性Pten^Het小鼠在第4天和第5天表现出明显的落杆潜伏期减少，而雌性小鼠除第1天外无显著差异，表明Pten单倍剂量不足对运动学习和协调的影响存在性别依赖性。胶带移除测试显示，雄性及雌性Pten^Het小鼠均出现反应延迟，提示感觉处理或反应启动存在缺陷。油滴实验诱发“抖水”行为（wet dog shakes），Pten^Het小鼠抖水次数显著多于野生型对照，说明C-LTMR介导的感觉运动反应增强。Von Frey实验显示，突变小鼠对低强度细丝（0.4–1.4 g）产生反应，而野生型小鼠对较高强度细丝（2–8 g）有反应，表明存在机械超敏。热探针实验发现，Pten^Het小鼠的撤退温度显著降低，表现出热超敏。这些行为结果表明，Pten单倍剂量不足导致多模式感觉异常，包括超敏、感觉整合缺陷及性别依赖性的运动协调障碍。

Pten杂合小鼠的DRG转录谱发生改变

通过RNA测序分析成年Pten^Het与野生型小鼠的DRG转录组，发现在Log2倍数变化阈值1.5时，鉴定出6个差异表达基因，其中4个上调、2个下调。基因本体分析显示，这些基因涉及代谢、RNA加工、信号转导和泛素化通路。值得注意的是，Pten在突变样本中表达略有上调，可能由于补偿性自动调节或DRG亚型间表达分布的改变。通过整合单细胞RNA测序数据并进行细胞类型比例推断，发现Pten^Het小鼠的DRG中亚型转录组比例发生改变，尤其是C-LTMR、肽能伤害感受器和本体感受器群体。

DRG亚型特异性标志物表达在Pten杂合小鼠中发生改变

对P21小鼠腰段DRG进行免疫组化分析，发现Isl1/2阳性神经元总数无显著差异，但特定亚型比例发生变化。TH阳性C-LTMRs增加156%，TrkC阳性本体感受器增加56%，而TrkA阳性肽能伤害感受器减少53%。IB4阳性非肽能伤害感受器、Calbindin阳性Aβ-LTMRs和TrkB阳性Aδ-LTMRs则未受影响。使用次级标志物（如Cav4.1、Etv1和CGRP）验证，发现共定位模式与野生型一致，表明这些变化反映了亚型分化缺陷，而非单纯标志物表达异常。

Pten杂合突变体中早期DRG发育异常

在胚胎发育期间（E10.5–E14.5），检测早期神经元标志物表达。TrkA谱系在整个发育时间点比例均显著降低，TrkB谱系无显著变化，而TrkC谱系在E10.5至E12.5期间比例升高。细胞增殖（EdU标记）和发育性凋亡（活化Caspase-3染色）分析显示，Pten^Het与野生型在DRG发育期间无显著差异，表明亚型比例变化源于分化异常而非细胞数量改变。

下游信号通路在Pten杂合突变体中发生改变

PTEN是PI3K/AKT信号的主要负调控因子，调节TSC/mTOR/S6和GSK-3β/β-catenin通路。通过pS6免疫染色（mTOR通路活性读值）和TCF/Lef:H2B-GFP报告小鼠（WNT/β-catenin活性读值），发现Pten^Het突变体中pS6和GFP阳性神经元比例增加。亚型分析显示，TrkA和TrkC神经元中pS6阳性比例显著增加，而TrkB神经元无变化；仅TrkC神经元中GFP阳性比例显著增加，表明PTEN单倍剂量不足导致DRG发育中亚型特异性的信号通路失调。

ASD相关Pten突变小鼠中DRG神经元多样化异常

在携带患者特异性Pten^Y68H突变的小鼠中，DRG亚型比例改变与Pten^Het模型高度一致：TH阳性C-LTMRs和TrkC阳性神经元增加，TrkA阳性肽能伤害感受器减少，其他亚型无显著变化。这进一步证实了PTEN水平精确性对DRG发育的关键作用，并突出了本研究结果的临床相关性。

讨论

PTEN作为PI3K/AKT信号的关键负调控因子，在神经系统发育、功能和再生中具有重要作用。本研究通过行为分析、转录组谱分析以及DRG发育的体内分析，确定了Pten在初级感觉神经元亚型特异性分化控制中的关键作用。这些结果从发育机制层面为综合征型ASD模型感觉异常的出现提供了分子基础。

研究显示，Pten单倍剂量不足导致感觉神经元亚型分化异常，涉及mTOR和GSK-3β/β-catenin信号通路的亚型特异性失调。这些通路在TrkC神经元中均过度激活，在TrkA神经元中仅mTOR通路激活，而在TrkB神经元中两者正常，表明不同感觉谱系对Pten基因剂量的敏感性存在差异。这种差异可能反映了特定Trk受体下游信号通路调控的内在不同。

行为上，Pten^Het小鼠表现出复杂的感觉表型，包括机械超敏、热超敏、感觉整合缺陷及性别依赖性的运动协调障碍。这些异常可能与DRG亚型比例改变相关，例如C-LTMRs增加可能导致触觉超敏，本体感受器异常可能影响感觉运动反馈。与其他ASD模型（如Mecp2、Shank3突变体）的研究一致，本研究进一步支持外周感觉功能障碍是ASD病理生理中常见且早期出现的特征。

本研究也存在一定局限性，例如未能直接检测Pten^Het DRG中的PTEN蛋白水平，也未进行电生理分析以验证神经元兴奋性改变。此外，感觉表型与特定细胞类型变化之间的因果关系仍需进一步探索。然而，胚胎期TrkA和TrkC谱系分化的早期破坏表明，发育改变是成年感觉功能异常的基础。

总之，本研究阐明了PTEN信号在体感神经元多样化中的关键作用，为ASD相关感觉异常提供了发育机制方面的见解，并为针对感觉症状的治疗策略提供了潜在靶点。