靶向成纤维细胞活化蛋白的CAR-T细胞通过诱导凋亡特异性清除心脏肌成纤维细胞：一项针对心肌纤维化治疗新策略的临床前研究

本刊推荐：本研究创新性地构建了靶向成纤维细胞活化蛋白（FAP）的第二代CAR-T细胞（含4-1BB共刺激域），通过慢病毒载体和脂质纳米颗粒（LNP）两种递送方式在Jurkat细胞模型中实现稳定表达。实验证实该CAR-T细胞可特异性识别并诱导表达FAP的心脏肌成纤维细胞（myoFb）凋亡，同时避免白细胞介素6（IL-6）过度分泌，为心肌纤维化的靶向治疗提供了新型安全有效的策略。

　　

1. 引言

心肌纤维化是多种心血管疾病的共同病理特征，其特征是心脏成纤维细胞在病理刺激下转化为活化的肌成纤维细胞（myoFb），过度分泌细胞外基质（ECM）导致心脏结构和功能异常。尽管现有治疗手段可缓解症状，但针对纤维化本身的靶向治疗仍缺乏有效策略。近年来，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在非肿瘤性疾病领域展现出潜力，而成纤维细胞活化蛋白（FAP）作为肌成纤维细胞的特异性表面标志物，成为治疗纤维化的理想靶点。

2. 材料与方法

本研究设计了一种第二代FAP靶向CAR结构，包含鼠源抗FAP单链可变区片段（scFv）、人CD8α铰链与跨膜区、4-1BB共刺激域及CD3ζ信号域，并引入 Regulatory Subunit I Anchor Disturber（RIAD）肽以增强免疫抑制耐受性。通过慢病毒载体和脂质纳米颗粒（LNP）两种方式递送CAR至人Jurkat T细胞系，评估其表达效率、细胞增殖及毒性。目标细胞包括稳定表达鼠FAP的HEK-293T细胞（FAP-293T）及血管紧张素II（Ang II）或转化生长因子-β（TGF-β）诱导的小鼠心脏肌成纤维细胞（myoFb）。采用Western blot、流式细胞术、乳酸脱氢酶（LDH）释放实验、酶联免疫吸附测定（ELISA）及凋亡染色等技术分析CAR表达、靶向杀伤能力及细胞因子分泌。

3. 结果

3.1. CAR分子设计与载体构建

成功构建pCDH-EF1-MCS-FAP-CAR质粒（经双酶切验证）并合成高纯度（92.6%）的FAP-CAR mRNA（含101聚腺苷酸尾和帽结构）。

3.2. 病毒与LNP制备

慢病毒颗粒浓度达10⁶–10⁷ pg/mL（P24 ELISA检测）。LNP粒径<200 nm，多分散指数（PDI）≈0.2，Zeta电位>+40 mV，电镜显示球形形态，4°C保存7天内稳定性良好。

3.3. CAR在Jurkat细胞中的表达

慢病毒转导组CAR表达率最高达28.5%（流式检测），且表达稳定超过10代；Western blot显示CD3ζ内参验证成功。CCK8实验表明CAR-Jurkat细胞增殖显著增强（p<0.01），体现4-1BB域的促增殖作用。LNP转导组在10 μg/mL浓度下CAR表达最优，但7天后因mRNA降解导致表达丢失。

3.4. 目标细胞模型建立

FAP-293T细胞中FAP表达率71.8%（流式验证）。Ang II（1 μM）或TGF-β（10 ng/mL）处理48小时后，心脏成纤维细胞中α-SMA、波形蛋白、FAP及胶原蛋白I/III表达显著上调（Western blot及免疫荧光验证），成功诱导肌成纤维细胞表型。

3.5. CAR-Jurkat的靶向杀伤效应

在效应细胞与靶细胞比例（E:T）为10:1时，CAR-Jurkat细胞与FAP⁺ myoFb共培养后：

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  IFN-γ分泌显著升高（ELISA检测，p<0.001），而IL-6水平始终<25 ng/L，无细胞因子释放综合征（CRS）风险；

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  LDH释放实验显示特异性杀伤率显著高于对照组（p<0.01）；

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  凋亡染色（Annexin V/PI）及Western blot（Bax/Caspase 3上调、Bcl-2下调）证实凋亡为主要死亡机制；

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  共聚焦显微镜显示CAR-Jurkat细胞仅聚集于FAP⁺细胞周围，无脱靶效应。

4. 讨论

本研究首次在Jurkat模型中验证了4-1BB基FAP-CAR的靶向杀伤能力与安全性优势。相较于CD28域，4-1BB域表现出更低的细胞因子释放和更持久的增殖潜力，但需在原代T细胞及体内模型中进一步验证。FAP靶点虽具特异性，但其在骨髓基质细胞的表达提示潜在脱靶风险（如贫血或骨丢失），未来需探索更特异性的肌成纤维细胞标志物（如心内膜来源成纤维细胞表面抗原）。LNP递送虽实现瞬时表达，但转导效率低于慢病毒，需通过抗体修饰提升靶向性。Jurkat细胞的固有信号激活特性限制其直接推演至原代T细胞的能力，后续研究需采用原代鼠/人T细胞及心肌纤维化动物模型评估治疗效力与安全性。

5. 结论

第二代FAP-CAR（含4-1BB域）通过慢病毒或LNP递送可在Jurkat细胞中实现功能性表达，并特异性清除FAP⁺肌成纤维细胞，且不引发过量IL-6分泌。本研究为心肌纤维化的CAR-T治疗提供了初步概念验证，但需进一步在原代细胞及体内模型中评估其临床转化潜力。