过敏性鼻炎非花粉季节持续性记忆B细胞亚群失调的免疫特征与临床意义

本研究发现，过敏性鼻炎（AR）患者在非花粉季节仍存在系统性B细胞失调，表现为IgG1+、IgG2+和IgA+记忆B细胞减少，IgG4+和κ+ B细胞增多，CD86+IgM+记忆样B细胞显著降低。这些发现揭示了AR患者免疫失衡的持续性特征，为开发非季节性生物标志物和靶向治疗提供了新方向。

　　

1 引言

过敏性鼻炎（Allergic Rhinitis, AR）是一种常见的上呼吸道慢性炎症性疾病，其特征是针对环境过敏原的免疫球蛋白E（IgE）介导的免疫反应。尽管辅助性T细胞2（Th2）和IgE在AR发病机制中的作用已得到充分证实，但越来越多的证据表明B细胞在过敏性疾病中扮演更广泛和复杂的角色。除了产生IgE外，B细胞还参与免疫记忆、类别转换重组（class-switch recombination）、细胞因子分泌和抗原呈递，这些过程共同塑造了过敏性炎症的进展。尽管B细胞具有关键作用，但AR中B细胞亚群的组成和功能动态，特别是在花粉游离期，仍然不完全清楚。

在非花粉季节对B细胞进行分析为研究在过敏原暴露期之外持续存在的基线免疫改变提供了机会，这些改变可能反映长期的免疫印记、疾病慢性化或与预测和预防相关的生物标志物。B细胞的发育始于骨髓，造血祖细胞通过免疫球蛋白基因重排分化为初始B细胞（na?ve B cells）。这些初始B细胞表达膜结合免疫球蛋白，主要是IgM和IgD，并进入血流。在次级淋巴器官（如淋巴结）中遇到抗原后，B细胞在滤泡辅助性T细胞（T follicular helper cells, Tfh）的帮助下被激活。活化的B细胞沿两条主要途径分化：一些成为能够快速再激活的记忆B细胞，而另一些则分化为分泌大量抗体的浆细胞（plasma cells）。这些浆细胞可能归巢到外周组织或返回骨髓，有助于长期的体液免疫。

B细胞亚群的特征依赖于免疫球蛋白亚型和表面标志物的分析。IgG亚类（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）执行不同的免疫功能：IgG1和IgG3是补体和Fc受体途径的有效激活剂，IgG2主要靶向多糖抗原，而IgG4与慢性抗原暴露和耐受相关，尤其在过敏性疾病中。类似地，IgA存在两种亚型，IgA1和IgA2，两者都通过在上皮表面中和过敏原而对黏膜免疫至关重要。κ（kappa）和λ（lambda）轻链为了解B细胞受体库多样性提供了视角，κ:λ比率的偏差提示克隆扩增或慢性免疫刺激。标志物如IgD和CD27可区分初始（IgD⁺CD27^?）和记忆（CD27⁺）B细胞，识别抗原经历。CD86表达标志B细胞活化，而CD24是另一个重要的表面分子，通过免疫检查点样功能参与炎症反应的调节。分析这些免疫球蛋白亚类和表型标志物为理解过敏性疾病如AR中B细胞失调提供了一个全面的框架。

2 材料与方法

2.1 患者材料

外周血采集自总共28名个体，包括临床诊断的AR患者（n=14）和健康对照（HC; n=14），时间在花粉季节之外。所有参与者在桦树和草花粉季节开始前至少2个月采样，确保免疫分析的花粉游离基线。参与者符合纳入标准，即有因桦树和/或蒂莫西花粉引起的季节性AR确认史、皮肤点刺试验阳性以及血液中过敏原特异性IgE水平至少为0.35 kE/L。排除标准包括近期上呼吸道感染（过去2周内）、近期使用局部或全身性皮质类固醇（过去2个月内）、入组前24小时内服用抗组胺药。

2.2 伦理声明

所有参与者提供了书面知情同意。该研究获得了瑞典伦理审查局（档案号2021-00325和2021-06514-02）的批准，并依据赫尔辛基宣言进行。所有程序，包括患者数据的处理，均符合这些伦理指南。

2.3 流式细胞术面板

通过标准密度梯度离心分离外周血单核细胞（PBMCs）。随后使用B细胞分离试剂盒II（Miltenyi Biotec, #130-091-151）和LS磁柱通过阴性选择从PBMCs中分离B细胞。简要来说，1000万个PBMCs与生物素缀合的抗体混合物和抗生物素微珠孵育以标记非B细胞。标记的细胞保留在LS柱的磁场中，而未标记的CD19⁺和CD20⁺ B细胞在流穿液中收集。为最大化B细胞产量，柱子洗涤三次。磁标记的非B细胞分别洗脱并储存。

分离的B细胞重悬于DMEM中并转移至试管进行染色。为减少非特异性结合，细胞根据制造商说明与人Fc受体阻断试剂（BD Biosciences, Cat# 564765）预孵育。然后使用支持信息S1:表1中指定的流式细胞术面板进行表面染色，该面板包括B细胞身份标志物（CD19、CD20）、成熟标志物（CD24、CD38、CD27、CD86、CD138）、免疫球蛋白亚型（IgM、IgD、IgE、IgA1/IgA2、IgG1-4）和轻链（κ、λ）。染色后，细胞洗涤并固定在1%多聚甲醛中。使用BD Horizon Fixable Viability Stain 780（BD Biosciences）进行活/死细胞区分。

样品使用LSR Fortessa X20流式细胞仪（BD Biosciences）在标准化设置下获取。平均每个样品记录约730,000个总事件，最终分析中包含10,000–30,000个CD19⁺ B细胞。使用FlowJo v10（BD Biosciences）分析数据。

2.4 统计分析

使用GraphPad Prism软件v10（San Diego, California）分析数据。所有比较在两个独立组（AR vs. HC）之间进行。在进行组比较之前，使用GraphPad Prism中的内置正态性检验检验数据的正态性和对数正态性。对于正态分布或对数正态数据，使用非配对t检验；否则，应用非参数Mann-Whitney U检验。数据显示为个体值及均值±标准差（SD）。为可视化，对数刻度图中的0值替换为0.0001。统计学显著性设定为p < 0.05。

3 结果

首先评估了外周B细胞亚群的分布，包括常规记忆（IgD^?CD27⁺）、非转换记忆（IgD⁺CD27⁺）、初始（IgD⁺CD27^?）和非常规记忆群体（IgD^?CD27^?）。在花粉游离期，AR患者与健康对照（HC）之间未观察到显著差异。

接下来分析了常规记忆B细胞内的免疫球蛋白亚类表达。AR患者表现出显著较低的IgG1⁺和IgG2⁺细胞频率，同时IgG4⁺细胞显著增加。IgG3表达保持不变。此外，AR患者中IgA1⁺和IgA2⁺记忆B细胞减少，而IgE⁺记忆B细胞频率在组间无差异。

评估CD86表达以分析B细胞活化状态。AR患者中CD86⁺ IgM⁺记忆样B细胞的频率显著低于HC，而CD86^?初始B细胞的频率无显著差异。然而，平均荧光强度（MFI）分析显示，尽管频率较低，AR患者中IgM⁺记忆样B细胞上的CD86表达有升高趋势，而初始B细胞上的CD86 MFI在组间保持不变。

此外，κ⁺/λ⁺比率分析显示HC和AR之间无显著差异。相反，轻链分析表明AR患者中κ⁺ B细胞频率较高，而λ⁺ B细胞无显著差异。需要澄清的是，κ⁺ B细胞频率的增加并未显著改变κ:λ比率，这可能是由于λ⁺ B细胞同时存在但不显著的增加所致。

详细的设门策略见支持信息S1:图1–7。

4 讨论

本研究在非花粉季节对AR患者和HC的外周B细胞亚群和免疫球蛋白亚类进行了分析。主要B细胞群体（包括初始、非转换记忆、转换记忆和非常规双阴性B细胞）的总体分布在AR患者和HC之间具有可比性。然而，在记忆B细胞区室内观察到了特定的失调。

本研究将亚型分析重点放在常规类别转换记忆B细胞（IgD^?CD27⁺）上，因为它们在与回忆反应和免疫球蛋白类别转换重组相关的作用已得到确认。该亚群为研究产生IgG亚类、IgA和IgE的抗原经历细胞提供了最生物学相关的背景。为避免背景和不确定性，未分析非常规记忆B细胞（IgD^?CD27^?）中的亚型，因为它们的低频率、未明确的功能以及数据集中有限的标志物分辨率。然而，我们承认该亚群可能仍有助于过敏性免疫失调，应在未来研究中予以考虑。

AR患者表现出IgG1⁺和IgG2⁺常规记忆B细胞频率降低，同时IgG4⁺记忆B细胞频率增加。表达IgA1⁺/IgA2⁺的记忆B细胞也减少。

此外，表达活化标志物CD86的IgM⁺记忆样B细胞的一个亚群在AR患者中显著较低，而初始CD86^? B细胞的频率保持不变。观察到κ轻链阳性B细胞的流行率较高，而λ⁺ B细胞无显著差异。最后，CD38/CD24分析显示B细胞亚群分布无显著差异。

尽管AR和HC之间主要B细胞亚群的比例似乎保持，这可能反映了花粉季节外过敏原驱动免疫过程的静息状态。然而，先前的研究，如Luo等人报道，在花粉季节外记忆B细胞和浆细胞增加，伴随初始B细胞减少，提示细微的免疫改变可能持续存在。研究间的差异可能源于队列规模或表型分析策略的不同。尽管初始/记忆B细胞分布明显稳定，功能相关亚群可能仍然失调。因此，AR患者可能总体上保留正常数量的记忆B细胞，但这些细胞可能表现出偏向促过敏状态的表型。

我们进一步确定了记忆B细胞内IgG亚类组成的偏向。IgG1⁺和IgG2⁺记忆B细胞的频率降低，而IgG4⁺记忆B细胞增加（IgG3⁺记忆细胞未注意到差异）。IgG1和IgG2通常在对蛋白质和多糖抗原的反应中占主导地位，它们的减少可能反映免疫偏离或经典记忆反应的耗竭。相反，IgG4与慢性抗原暴露和耐受相关。先前的研究表明，成功的过敏原免疫疗法（AIT）增加IgG4⁺记忆B细胞和血清IgG4水平，与临床改善相关，如Heeringa等人所示。尽管本研究中没有参与者正在接受主动AIT，但不能完全排除先前或未报告的免疫疗法暴露可能影响了观察到的IgG4⁺记忆谱。在未经治疗的AR患者中，升高的IgG4⁺记忆亚群可能反映重复的季节性过敏原暴露驱动部分免疫调节适应。如Qin等人强调，IgG4在过敏性疾病中可充当“双刃剑”，提供保护性阻断作用的同时标记慢性过敏原刺激。我们的发现与这一解释一致，表明AR中IgG4⁺记忆的发展可能作为对持续过敏性炎症的补偿性但不完全的对策。

还观察到AR患者中IgA1⁺/IgA2⁺记忆B细胞减少。IgA在黏膜表面的免疫排除中起关键作用，其缺乏与过敏易感性增加相关。我们的发现与Zheng等人报道一致，其中循环IgA⁺记忆B细胞在AR患者中减少并在AIT后恢复。IgA记忆细胞与IL-10⁺调节性T细胞正相关，与症状严重程度负相关，支持其在过敏性炎症中的调节作用。AR中黏膜IgA记忆的生成或维持受损可能反映TGF-β或IL-10信号传导失败，有利于Th2驱动的IgE和IgG4反应。这些结果突出了AR中潜在的免疫学差距，对疾病易感性和持续性具有重要影响。这种IgA缺乏也可能损害黏膜屏障完整性或改变微生物稳态，可能有助于AR中持续的免疫失调。最小持续性炎症的概念描述了即使在过敏原暴露之外也存在的持续黏膜炎症，可能有助于解释我们的发现。观察到的B细胞改变，尽管没有花粉，表明了一种持久的免疫印记，可能导致持续性鼻敏感性和亚临床炎症，如在常年有症状的过敏个体中所描述。

通过共刺激分子CD86评估的B细胞活化状态显示，AR患者中CD86⁺ IgM记忆样B细胞减少，而初始CD86^? B细胞的频率不受影响。CD86对抗原呈递和T细胞共刺激至关重要。尽管CD86⁺记忆B细胞的减少在炎症性疾病中可能显得矛盾，但它可能反映过敏原特异性B细胞的花粉季节外静息状态或调节适应。先前的研究表明，过敏原暴露选择性诱导特应性个体B细胞中的CD86表达，提示AR B细胞在刺激时准备好激活但在花粉季节外保持非活动状态。或者，重复过敏原暴露可能诱导耗竭或无能的记忆B细胞表型。此外，Yao等人报道，AR中的记忆B细胞显示异常的CD23表达，促进IgE介导的抗原呈递而非经典的CD86 CD28共刺激。总的来说，这些发现表明AR中过敏原特异性B细胞可能倾向于替代激活途径和与T细胞的改变相互作用。

观察到AR患者中κ⁺轻链表达B细胞升高，而组间κ:λ轻链比率无显著差异。在正常情况下，该比率近似2:1，反映随机轻链重排。最近的研究表明，游离免疫球蛋白轻链本身可以作为炎症介质。具体地，κ轻链蛋白已被证明可激活肥大细胞并独立于IgE促进过敏性炎症。在严重哮喘患者中，Basile等人报道了游离κ轻链血清水平升高，与嗜酸性粒细胞炎症相关。类似地，Powe等人在过敏性鼻炎个体的鼻分泌物中观察到游离轻链增加，并鉴定出鼻黏膜中Igκ/Igλ阳性细胞，主要由肥大细胞和浆细胞组成。这些发现支持了在AR中观察到的κ偏向B细胞反应可能通过肥大细胞激活促进局部炎症的假设，独立于IgE。该机制代表了AR中免疫激活的潜在新途径，值得进一步研究。

最后，使用先前建立的设门策略进行了CD38和CD24表达分析，显示AR患者和HC之间B细胞亚群分布无显著差异。记忆B细胞（CD38^?CD24⁺）的频率（对维持长期免疫记忆重要）在组间可比，提示记忆B细胞区室在AR中未显著改变。类似地，过渡B细胞（CD38⁺CD24⁺）（代表刚从骨髓迁出的未成熟B细胞）以及初始B细胞（CD38⁺CD24^?）显示无显著差异，表明早期B细胞发育和外周进入在AR中基本保持。浆细胞（CD38⁺⁺CD24^?）（反映终末分化的抗体分泌细胞）在组间也无显著差异。这些发现提示，基于CD24/CD38分析，B细胞成熟和分化的主要阶段在AR患者中保持，在过敏原暴露季节外的外周血中未检测到向活化或终末分化的明显转变。

5 研究局限性

尽管我们的发现为了解非季节AR中记忆B细胞失调提供了宝贵见解，但必须承认几个局限性。首先，适中的样本量可能限制统计功效和普遍性。B细胞亚群的细微差异可能未被检测到，需要更大队列验证这些观察结果。其次，横断面设计限制了对花粉和非季节期间动态变化的评估；纵向研究将提供更深入的见解。第三，尽管我们的表型特征全面，但流式细胞术不评估B细胞功能，如细胞因子产生或抗原特异性，这限制机制解释。

我们还承认，IgE⁺记忆B细胞极其罕见，通过流式细胞术检测具有技术挑战性。我们使用直接表面染色而未富集或体外刺激可能导致由于其低事件计数和潜在背景染色而高估其丰度。最后，未并行评估血清免疫球蛋白亚类水平和细胞因子谱，这可能提供额外的系统背景。

6 结论

总之，过敏性鼻炎患者即使在非季节期间也表现出其记忆B细胞区室的持续性改变。这些包括向IgG4记忆的转变，IgG1⁺、IgG2⁺和IgA⁺记忆B细胞减少，IgM记忆样细胞上活化标志物表达降低，以及κ:λ轻链失衡。 together，这些特征表明可能塑造未来过敏原反应的持久免疫印记。临床上，B细胞分析可能支持疾病监测和治疗靶向的生物标志物开发。未来的过敏原免疫疗法策略可能受益于增强IgA记忆、恢复IgG亚类平衡和促进调节性B细胞功能的方法。这些发现强调了B细胞导向方法在过敏性鼻炎管理中的相关性。