基于纳米孔测序的头颈部鳞癌DNA甲基化生物标志物预测与甲基化特异性PCR验证研究

为解决头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）缺乏有效早期诊断标志物的问题，研究人员利用纳米孔测序技术开展DNA甲基化生物标志物筛选研究。通过仅使用3例肿瘤和3例对照样本的测序数据，成功预测并设计出多个高灵敏度、高特异性的甲基化特异性PCR（MSP）引物，在48例HNSCC和46例对照样本验证中，4个标志物的AUC超过0.8。该研究为开发低成本、高效的癌症早期诊断试剂盒提供了新策略。

　　

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是一种常见的恶性肿瘤，超过一半的患者在确诊时已处于晚期阶段，这严重影响了治疗效果和患者生存率。尽管HNSCC的分子机制已被广泛研究，但目前临床上仍缺乏有效的早期诊断方法。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，在癌症发生早期就会出现特异性改变，因此具有作为肿瘤生物标志物的巨大潜力。然而，传统甲基化检测方法如Illumina甲基化芯片覆盖范围有限，全基因组甲基化测序成本高昂，限制了临床转化应用。

在这项发表于《Clinical Epigenetics》的研究中，研究人员开发了一种基于纳米孔测序的高效甲基化生物标志物发现流程。该研究创新性地利用少量样本即可实现高精度甲基化标志物筛选，为癌症早期诊断提供了新的技术路径。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：使用牛津纳米孔技术（ONT）进行全基因组甲基化测序，采用适应性采样（adaptive sampling）策略富集CpG岛区域；利用diffMONT工具预测差异甲基化区域（DMR）并设计MSP引物；通过甲基化特异性PCR（MSP）在94例临床样本（48例HNSCC和46例对照）中进行验证；使用统计学方法评估诊断性能，包括受试者工作特征曲线（ROC）分析和Youden指数计算。所有组织样本均来自耶拿大学医院，经过伦理委员会批准。

纳米孔测序数据集在CpG岛上达到10X测序深度且肿瘤细胞百分比为70-80%

研究人员选择了3例男性HNSCC组织样本（肿瘤细胞百分比70-80%）和3例男性对照样本进行纳米孔测序。通过适应性采样技术，成功将CpG岛区域的测序深度提升至11.98X-28.66X，满足了可靠的DNA甲基化分析要求。所有样本的全基因组覆盖度在4.65X-8.44X之间，为后续分析提供了高质量数据基础。

计算机预测的区域分布所有染色体并与CpG岛和注释基因重叠

使用diffMONT工具对6个纳米孔测序样本进行分析，共预测出50,479个差异甲基化区域，这些区域分布在所有染色体上。其中95.92%的区域与注释的CpG岛重叠，82.32%与注释基因重叠。研究人员根据甲基化和覆盖度评分筛选出284个高分区域（评分>6000），为进一步研究提供了候选标志物。

所有高分预测区域与CpG岛重叠但处于不同的基因组环境中——有些与已知的HNSCC基因重叠

经过聚类过滤后，最终确定了23个独特的MSP区域，分布在13条染色体上，全部位于CpG岛上。这些区域具有不同的基因组背景：有些与基因启动子区域重叠，如USP44基因；有些位于双向启动子区，如ZNF529和ZNF382基因；还有些位于基因间区域。最高评分的预测区域位于USP44基因的CpG岛上，该基因在鼻咽癌中已被报道存在启动子超甲基化。

基于计算机预测区域的引物设计

从23个独特MSP区域中，研究人员选择了16个区域进行引物设计，最终设计了20对引物组合。引物设计遵循了严格的标准：引物长度14-22nt，扩增子长度80-400bp，包含至少3个甲基化CpG位点，GC含量约60%，熔解温度差异<5°C。

引物性能的分析评估

通过梯度PCR和探针功能验证，研究人员从20对引物中筛选出16对性能良好的引物。经过稀释系列测试和特异性验证，最终有10对引物-探针组合表现出良好的分析性能。其中FAM43A-PP1⁶¹¹³、KREMEN2-PP1⁶⁵⁹⁴和BEND4-PP1⁶⁴¹⁷由于在0.1ng输入模板下扩增效率不佳而被排除。

使用MSP验证设计的引物显示在HNSCC和对照中具有诊断潜力

首先在用于纳米孔测序的3对对照和3例HNSCC样本中进行验证，结果显示除KCNB1-PP2⁶⁷⁰⁷在一个HNSCC样本中表现异常外，其余5个标志物在肿瘤样本中均显示较低的ΔC_T值，而在对照样本中显示较高的ΔC_T值，与纳米孔测序数据一致。

选定的引物对在临床OSCC样本中显示诊断潜力

在17例口腔鳞状细胞癌（OSCC）和46例对照样本中验证，5个标志物（除LHX8-PP1⁶⁰⁰⁹外）显示出显著差异。ZNF529-PP1⁷⁴⁸⁰表现最佳，可实现完美分类（AUC=1），FLI1-PP1⁷⁹⁹⁰、USP44-PP2⁹⁹³⁸、KCNB1-PP2⁶⁷⁰⁷和URAD-PP1⁶²⁴⁷的AUC均超过0.8。

从OSCC中筛选的引物在48例临床HNSCC样本中显示出强大的诊断性能

最终在48例HNSCC样本（包含17例OSCC）和46例对照样本中验证，结果显示4个标志物（FLI1-PP1⁷⁹⁹⁰、KCNB1-PP2⁶⁷⁰⁷、ZNF529-PP1⁷⁴⁸⁰和URAD-PP1⁶²⁴⁷）具有优异的诊断性能，AUC超过0.8，灵敏度 above 0.7，特异性 above 0.95，Youden指数 above 0.68。值得注意的是，这些引物仅基于3例男性口腔癌样本设计，但在包含不同性别、年龄、肿瘤位置和HPV状态的多样化样本中仍保持良好性能。

该研究证实，基于纳米孔测序的甲基化标志物发现流程仅需3例肿瘤和3例对照样本即可成功预测出高性能的MSP引物。在临床验证中，5个预测标志物中的4个显示出非常好的诊断准确性（AUC>0.8），其中ZNF529-PP1⁷⁴⁸⁰和URAD-PP1⁶²⁴⁷表现尤为突出。这种方法具有25%的成功率，远高于传统方法，显著降低了标志物发现的经济成本和时间消耗。

虽然这项研究的目的不是开发最终的临床检测试剂盒，但它为在更大队列中设计和测试类似检测方法提供了重要工具。未来的研究方向包括将多个标志物组合成多重MSP检测以减少每个样本的反应次数，以及在非侵入性样本（如唾液或涂片）中进行验证。这项研究展示了从少量组织样本设计临床相关且高度适应性MSP检测方法的潜力，为癌症和疾病诊断的更广泛应用铺平了道路。