Tm-1重出江湖：来自Solanum pennellii种质的等位基因在ToBRFV抗性中起主要作用

为解决番茄褐色皱纹果病毒（ToBRFV）对全球番茄生产的严重威胁，研究人员开展了针对野生番茄近缘种Solanum pennellii抗性机制的研究。他们发现其Tm-1等位基因是抗性的主要控制基因，但完全抗性还需一个额外的隐性位点。该研究为番茄抗病育种提供了新的基因资源和理论依据，对可持续防控ToBRFV具有重要意义。

　　

番茄（Solanum lycopersicum）是全球广泛种植的重要蔬菜作物，在商业农业和地方经济中扮演着关键角色。然而，番茄生产正面临着病毒病的严重威胁，其中番茄褐色皱纹果病毒（Tomato brown rugose fruit virus, ToBRFV）自2014年在中东首次发现以来，已迅速传播到亚洲、欧洲和美洲的多个国家，成为全球番茄产业最严重的威胁之一。

ToBRFV属于烟草花叶病毒属（Tobamovirus），是一种机械传播的病毒，含有单链正义RNA基因组。该病毒引起的病害症状包括果实表面的褐色粗糙斑块、叶片花叶和形态异常，以及在感染后期植株的完全崩溃。由于高度传染性，ToBRFV通过受污染的工具、人体接触、昆虫传粉媒介、土壤和植物材料迅速传播。尽管农业和卫生措施有助于防止传播，但尚无化学处理方法可以治愈受感染的植株，这使得抗性育种成为最可持续和有效的控制策略。

历史上，番茄对烟草花叶病毒属的抗性依赖于 well-characterized 的基因，如Tm-1和Tm-2/Tm-22，它们提供对烟草花叶病毒（TMV）和番茄花叶病毒（ToMV）株系的保护。然而，当ToBRFV出现时，所有商业番茄品种都表现出感病性，即使那些对其他烟草花叶病毒如ToMV具有抗性的品种也是如此，这主要归因于ToBRFV能够克服主要的抗性基因Tm-2/Tm-22。这一情况促使研究人员寻找能够抵抗ToBRFV感染的新抗性特征。

近年来，多项研究聚焦于鉴定适用于番茄育种计划的ToBRFV抗性特征。野生番茄物种被证明是ToBRFV抗性的宝贵来源，多个茄属物种（S. pimpinellifolium, S. chilense, S. corneliomulleri, S. habrochaites, S. peruvianum, 和 S. ochranthum）的种质都显示了对ToBRFV的抗性。然而，能够克服这些抗性特征的ToBRFV分离株已经被报道，凸显了RNA病毒如ToBRFV的快速抗性突破潜力，并强调了继续努力发现能够提供持久保护的其他抗性特征的紧迫性。

在这项研究中，研究人员在多个番茄野生近缘种中筛选ToBRFV抗性，最终在Solanum pennellii的种质中鉴定出了强大的抗性。他们证实控制这一抗性特征的主要基因是S. pennellii的Tm-1等位基因。Tm-1最初在S. habrochaites中被鉴定为一个半显性的番茄花叶病毒（ToMV）抗性基因，编码一个754个氨基酸的蛋白质，通过结合病毒复制蛋白的解旋酶结构域来抑制烟草花叶病毒的复制。研究结果表明，对ToBRFV疾病的完全抗性还需要一个来自抗性S. pennellii种质的额外未描述位点。这些结果显示了S. pennellii作为对抗ToBRFV的新抗性来源的潜力。

本研究由荷兰瓦赫宁根大学与研究中心（Wageningen University & Research）的植物育种团队完成，研究成果发表在《Theoretical and Applied Genetics》期刊上。为了开展这项研究，研究人员运用了几个关键技术方法：首先通过对10个S. pennellii种质和栽培番茄品种Moneymaker进行ToBRFV接种实验，筛选出抗性种质；随后通过遗传杂交创建F₁和F₂群体进行遗传分析；利用疾病严重指数（DSI）进行表型鉴定；开发CAPS（Cleaved Amplified Polymorphic Sequences）标记进行基因分型；采用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术进行功能验证；通过基因克隆和测序分析Tm-1等位基因变异；还进行了批量分离分析（BSA）和全基因组标记筛选来定位次要抗性位点。

Responses of S. pennellii accessions to ToBRFV inoculation

研究人员筛选了野生茄属种质对ToBRFV的抗性，结果鉴定出多个对ToBRFV高度抗性的S. pennellii种质，以及感病的S. pennellii种质。每个S. pennellii种质和番茄cv. Moneymaker的十株植物接种ToBRFV，另外五株进行模拟处理作为对照。接种三周后，所有接种ToBRFV的cv. MM植株和五个感病S. pennellii种质（LA 1356, LA 1656, LA 1724, LA 2177, 和 LA 2580）都显示出严重的病毒症状，包括叶片形态异常和生长受阻，表明ToBRFV接种效率高。此外，ToBRFV免疫试纸条检测确认了病毒外壳蛋白（CP）的存在，表明病毒积累。相比之下，五个抗性S. pennellii种质（LA 0716, LA 0750, G1.1559, G1.1608, 和 G1.1610）的所有接种植株都没有表现出症状，ToBRFV免疫试纸条检测未检测到CP，意味着病毒积累量低或不存在。

Inheritance of ToBRFV resistance derived from LA 0716 and LA 0750

为了研究ToBRFV抗性的遗传，研究人员测试了来自cv. MM与LA 0716和LA 0750杂交的F₁和F₂植株。来自两个杂交的F₁个体在接种ToBRFV后表现出无到轻微的病毒疾病症状，如轻微花叶和叶片皱缩，与感病亲本MM相比症状较轻。蛋白质凝胶电泳显示，F₁植株中的CP积累处于抗性和感病亲本之间的中间水平，表明在这些S. pennellii种质中鉴定的抗性不是由单个典型的显性或隐性基因控制的。

随后，255个F₂(LA 0716)个体接种ToBRFV，接种三周后使用疾病严重指数（DSI）进行表型评估。F₂(LA 0716)个体可分为三个不同的表型组：感病（S）植株显示严重症状（DSI: 2,3）和可检测的CP；中间（I）表型植株显示无或轻微症状（DSI: 0,1）和可检测的CP；抗性（R）植株显示无症状（DSI: 0）和无检测到的CP。F₂(LA 0716)群体中的表型分离比为15抗性（R）: 119中间（I）: 121感病（S），不符合预期的3(R):1(S)或1(R):3(S)分离比，进一步支持了抗性性状不是由单个典型的显性或隐性基因控制的结论。

Association analysis between genetic markers for Tm-1, Tm-2, and QTL11 and ToBRFV resistance trait

研究人员开发了区分MM和S. pennellii等位基因的CAPS标记，包括Tm-1基因（Tm-1标记）、Tm-2基因（Tm-2标记）、染色体11上的一个位点（QTL11标记）和染色体9上的一个位点（QTL9标记）。所有15个F₂(LA 0716)抗性组个体（DSI: 0，无检测到的CP）都含有来自S. pennellii抗性亲本的Tm-1等位基因，且为纯合状态（Tm-1 S.p.）。此外，大多数表现出最感病表型（DSI: 3，可检测CP）的植株是感病亲本Tm-1等位基因的纯合子（Tm-1 MM），表明S. pennellii的Tm-1位点参与赋予抗性。值得注意的是，随着表型组中症状严重程度的增加，携带Tm-1 S.p.等位基因的植株频率降低，且大多数具有中间表型（DSI: 0,1,2，可检测CP）的植株以杂合状态携带Tm-1等位基因，这可以通过假设S. pennellii的Tm-1等位基因具有半显性性质来解释。

然而，携带纯合Tm-1 S.p.的植株不仅存在于抗性表型组中，也以不同频率存在于其他表型组中，这表明完全ToBRFV抗性植株需要Tm-1 S.p.位点与一个附加基因的组合。仅考虑60个具有纯合Tm-1 S.p.的植株，并将它们分类为具有可检测CP（S）或不可检测CP（R）的植株，分离比为45 S: 15 R，完全符合3:1的分离，这强烈表明与Tm-1 S.p.组合实现完全ToBRFV抗性所需的附加基因或位点是以隐性方式遗传的。

VIGS-mediated functional analysis of Tm genes in S. pennellii accessions in relation to ToBRFV resistance

为了确认Tm-1（而非与Tm-1位点连锁的其他基因）参与来自S. pennellii的ToBRFV抗性，研究人员使用VIGS技术在所有五个鉴定出的抗性S. pennellii种质的植株中沉默了Tm-1。沉默了三个不同的基因：Tm-1（疑似与抗性相关的候选基因）、Tm-2（作为阴性对照）和大肠杆菌GUS基因（在茄属物种中无同源物，作为第二个阴性对照）。VIGS接种两周后，显示基因沉默的植株接种ToBRFV。三周后，所有来自抗性S. pennellii种质的Tm-1沉默植株都表现出严重的ToBRFV症状，并且所有处理植株的ToBRFV免疫试纸条检测显示，仅在Tm-1沉默的植株中检测到CP，而在任何其他植株中均未检测到。症状的存在和CP的检测证实了Tm-1基因在赋予抗性S. pennellii种质对ToBRFV抗性中的参与。

Tm-1 allelic variation among Solanum accessions

研究人员通过PCR使用来自所有测试S. pennellii种质的cDNA扩增了Tm-1等位基因。所有抗性S. pennellii种质的Tm-1等位基因与注释的Tm-1(Sopen02g013570)基因100%相同；因此，仅使用一个来自抗性S. pennellii种质的Tm-1序列来预测其蛋白质序列。所有感病S. pennellii种质携带一个相同的tm-1等位基因，该等位基因与在抗性S. pennellii种质中发现的Tm-1等位基因不同。氨基酸序列比对显示，九个氨基酸区分了ToBRFV抗性Tm-1蛋白与感病变体，所有这些氨基酸都位于前201个氨基酸内，其中八个位于针对ToMV的正选择区域（氨基酸78-112）内，位置分别为57、78、79、80、85、87、89、94和100。此外，在ToBRFV抗性S. pennellii的Tm-1蛋白中，位置459的一个独特氨基酸将其与所有其他Tm-1变体区分开来。

研究结论表明，Solanum pennellii种质是ToBRFV抗性的宝贵来源，其中S. pennellii Tm-1等位基因起关键作用。比较抗性和感病种质的Tm-1氨基酸序列揭示了九个可能与Tm-1抗ToBRFV功能相关的氨基酸差异。此外，完全抗性需要一个次要位点，可能以隐性方式遗传。值得注意的是，该位点与先前报道的与其他研究中的Tm-1协同作用的位点不重叠，表明其作为ToBRFV抗性新因子的潜力。这些发现对于专注于开发具有强大、持久ToBRFV抗性的番茄品种的育种计划具有重要价值。

讨论部分强调，ToBRFV对全球番茄生产构成威胁，且不断出现能够克服抗性基因的新分离株，这凸显了持续研究不仅需要鉴定和利用单个抗性基因，还需要发现具有多种抗性机制的多个基因的紧迫性。通过组合这些基因，可以开发多层次、持久的抗性来更有效地应对这一病毒威胁。本研究鉴定的S. pennellii抗性机制，特别是Tm-1等位基因的特异性氨基酸变异和尚未完全鉴定的隐性次要位点，为番茄抗病育种提供了新的遗传资源和分子靶点。此外，研究还发现不同ToBRFV分离株在复制蛋白和解旋酶结构域的氨基酸差异可能是导致不同研究中S. pennellii LA 0716对ToBRFV抗性表现不一致的原因，这提示在未来抗病育种中需要考虑病毒株系的变异性和进化潜力。